GITR-GITRL在支氣管哮喘大鼠中性粒細胞及肺泡巨噬細胞上的表達.pdf

1、目的:
　　 GITR/GITRL是一對共刺激分子，反映了體內(nèi)Treg的數(shù)量及功能狀況，參與了體內(nèi)復雜的免疫系統(tǒng)的反應。本實驗通過建立大鼠哮喘模型，檢測哮喘組、對照組和布地奈德干預組外周血PMN及肺泡巨噬細胞上的GITR/GITRL的表達情況，探討其與支氣管哮喘的關(guān)系及糖皮質(zhì)激素干預后對其表達的影響，為哮喘發(fā)病機制的進一步完善及糖皮質(zhì)激素治療提供一定的理論依據(jù)，并為進一步研究能否通過調(diào)節(jié)GITR/GITRL信號的共刺激活化途徑實

2、現(xiàn)哮喘的目標性免疫調(diào)節(jié)性治療提供新的思路。
　　 方法:
　　 清潔級5周齡雄性健康SD大鼠，隨機分為哮喘組（A組）、布地奈德干預組（B組）、對照組（C組），每組10只，用OVA制備哮喘模型，C組以生理鹽水代替OVA進行腹腔注射和霧化吸入，B組在激發(fā)階段予布地奈德混懸液霧化吸入治療。末次激發(fā)24小時后水合氯醛腹腔注射麻醉，心臟取血，結(jié)扎左肺留取肺組織，右肺行支氣管肺泡灌洗留取BALF。肺組織HE染色觀察病理變化;對血標本

3、進行PMN的分離提純，提取總RNA;計BALF沉渣中細胞總數(shù);對肺泡灌洗液中的肺泡巨噬細胞進行分離、純化、細胞爬片、提取總RNA;采用免疫細胞化學法測定GITR/GITRL蛋白在肺泡巨噬細胞上的表達;采用實時熒光定量PCR的方法檢測GITR/GITRLmRNA在肺泡巨噬細胞及外周血PMN的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、成功構(gòu)建大鼠支氣管哮喘模型:激發(fā)階段觀察到A組大鼠出現(xiàn)呼吸加快、腹部肌肉抽搐、全身發(fā)紺等癥狀，嚴重

4、者呼吸減慢，節(jié)律紊亂，部分典型的大鼠哮喘發(fā)作時可聞及明顯的哮鳴音。HE染色鏡下見A組大鼠小支氣管、血管粘膜下和周圍的肺組織有明顯的炎性浸潤，以淋巴細胞、EOS、PMN為主。
　　 2、BALF的細胞數(shù):各組大鼠BALF的回收量比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。BALF中的細胞計數(shù)結(jié)果顯示，A組、B組的BALF中細胞總數(shù)均高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0.01)。B組和C組的細胞總數(shù)分別低于A組，差異有統(tǒng)計學意義(均P＜0

5、.01)。
　　 3、成功分離出外周血PMN:分離到的PMN其數(shù)量大于106/ml;瑞氏染色顯示，PMN呈圓形，胞質(zhì)淡紅色，部分胞核可見分葉狀。
　　 4、成功分離出肺泡巨噬細胞:顯微鏡下觀察分離到的肺泡巨噬細胞呈圓形、透亮，培養(yǎng)40min-50min左右，可觀察到肺泡巨噬細胞逐漸貼壁，形狀呈現(xiàn)多態(tài)性，為圓形、橢圓形或其他不規(guī)則形狀，胞質(zhì)較前豐富，2h后細胞貼滿培養(yǎng)瓶的底部，細胞呈圓形或星形，有些呈不規(guī)則形狀，部分細胞可

6、見偽足和突起。
　　 5、實時熒光定量PCR結(jié)果: GITR/GITRLmRNA在各組的外周血PMN和肺泡巨噬細胞上均有表達，A組的外周血PMN和肺泡巨噬細胞GITR/GITRLmRNA相對表達水平高于C組和B組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。而B組與C組的外周血PMN和肺泡巨噬細胞GITR/GITRLmRNA相對表達水平相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 6、肺泡巨噬細胞免疫細胞化學結(jié)果:各組的肺泡

7、巨噬細胞上GITR/GITRL均有表達，其陽性表達主要在胞膜與胞漿。陰性對照片無棕黃色顆粒，僅見復染的細胞核。A組肺泡巨噬細胞的GITR/GITRL蛋白表達水平高于C和B組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。而B組與C組的肺泡巨噬細胞的GITR/GITRL蛋白表達水平相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、A組大鼠外周血PMN和肺泡巨噬細胞的GITR/GITRL表達高于C組，提示PMN和肺泡