hUCB-MSCs在大鼠視神經(jīng)急性損傷中的抗凋亡與促進再生的實驗研究.pdf

1、視神經(jīng)損傷在臨床很常見，很多眼科疾病都會導致視神經(jīng)損傷，最終導致視力下降甚至失明，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinalganglioncells，RGCs)的逐漸死亡是視神經(jīng)損傷后視覺障礙不可逆轉的一個重要原因，目前臨床上尚無有效的治療方法。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷類似，視神經(jīng)受損傷后，即有部分細胞壞死，殘存的神經(jīng)細胞因缺血、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放、鈣超載、炎癥反應等繼發(fā)性損傷而逐漸發(fā)生凋亡或死亡。經(jīng)典理論認為成年哺乳動物的視神經(jīng)損傷后是有再生反應，

2、但卻無再生能力。軸突損傷后，RGCs早期發(fā)生再生支芽，但不久就萎縮了，是“失敗”的再生。最近一二十年的基礎研究和動物實驗證明只要給予適當?shù)膬?nèi)外微環(huán)境，視神經(jīng)軸突在損傷后是可以再生的，因此促進受損的RGCs修復和再生是目前眼科研究的一個熱門話題。干細胞的發(fā)現(xiàn)為細胞替代治療和促進神經(jīng)修復帶來了希望，但以往胚胎干細胞和神經(jīng)元干細胞的應用涉及倫理道德的限制而影響其的應用。目前應用最多的是間充質(zhì)干細胞，間充質(zhì)干細胞來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，

3、具有多項分化能力、造血支持、免疫調(diào)控和自我復制等特點而日益受到人們的關注，并且在體內(nèi)或體外特定的誘導條件下，可分化為軟骨、脂肪、骨、肌肉、神經(jīng)等多種組織細胞，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復，是組織工程研究中較為理想的種子細胞。近幾年來間充質(zhì)干細胞一直被用于脊髓、腦缺血損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，研究顯示間充質(zhì)干細胞具有一定的神經(jīng)保護作用。本研究擬建立SD大鼠視神經(jīng)急性鉗夾損傷模型，并用人臍帶血間充質(zhì)干細胞(h

4、umanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，hUCB-MSCs)移植到大鼠的眼玻璃體腔內(nèi)，探索hUCB-MSCs對大鼠急性視神經(jīng)損傷的抗凋亡與促進神經(jīng)再生的作用，為將來彌補現(xiàn)有臨床治療手段的不足奠定實驗基礎，這對神經(jīng)眼科學的發(fā)展和眼科臨床都有重要意義。
　　 本課題研究包括兩部分，第一部分細胞實驗(hUCB-MSCs的分離、純化和鑒定)：采用密度梯度離心法和貼壁法從人臍帶血中分離提純間充

5、質(zhì)干細胞并鑒定。第二部分動物實驗(玻璃體腔內(nèi)移植hUCB-MSCs對大鼠急性視神經(jīng)損傷的抗凋亡與促進神經(jīng)再生作用)：將動物分為治療組、對照組和正常組，用熒光金(FluorogoldFG)逆行示蹤標記SD大鼠視神經(jīng)急性損傷模型的RGCs并計數(shù)；蘇木素-伊紅(HE)染色觀察視神經(jīng)急性損傷后和問充質(zhì)干細胞移植后視網(wǎng)膜的形態(tài)學變化；免疫熒光，WesternBlotting和Real-TimePCR分析神經(jīng)軸突中生長相關蛋白43(growthas

6、sociatedprotein43，GAP-43)蛋白的表達變化情況；免疫熒光和Real-TimePCR檢測ATP配體門控嘌呤受體P2X7蛋白的表達情況；免疫熒光檢測促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3蛋白的表達情況；Tunel原位檢測細胞的凋亡水平等手段比較各組的差別。
　　 本研究的主要結果如下：
　　 1.hUCB-MSCs體外分離純化培養(yǎng)體外分離純化的hUCB-MSCs與文獻報

7、道一致：光鏡下呈雙極狀態(tài)，兩個突起的長梭形或扁平形的成纖維樣細胞。流式細胞儀鑒定為：CD13、CD29、CD44、CD105、CD90呈現(xiàn)強陽性，而CD34、CD45，HLA-DR則表現(xiàn)為弱陽性，證實為間充質(zhì)干細胞。
　　 2.SD大鼠大腦立體定位熒光金逆行示蹤標記RGCs并計數(shù)無論對照組還是治療組RGCs數(shù)目都是隨時間逐漸遞減的，但同一時間點下治療組的RGCs數(shù)目都要比對照組多(P＜0.05)。
　　 3.HE染色無論

8、對照組還是治療組4個時間點RGCs數(shù)目逐漸減少，視網(wǎng)膜各層排列逐漸紊亂，并出現(xiàn)畸形核，有的神經(jīng)節(jié)細胞層出現(xiàn)長片段的細胞缺失，但治療組每個時間點下RGCs的數(shù)目、視網(wǎng)膜各層的紊亂程度都要比對照組佳。
　　 4.GAP-43蛋白的表達變化情況免疫熒光顯示正常視網(wǎng)膜內(nèi)各層GAP-43表達量極少，僅在內(nèi)叢狀層見很少量的表達，視神經(jīng)損傷后于對照組見表達量稍增加，第7d和14d較明顯，之后急劇下降；hUCB-MSCs移植治療組于第7d和14

9、d時GAP-43表達明顯增加并達峰值之后開始下降。Western檢測結果顯示無論是對照組還是治療組GAP-43蛋白表達第3d時和正常組的差異不大，第7d、14d蛋白表達明顯增高，但第14d蛋白水平比7d組的蛋白表達略少，開始下降。但治療組每個時間點下目的蛋白的表達水平的相對灰度值都要比對照組的高，這和免疫熒光檢測結果相一致；Real-TimePCR顯示目的基因GAP-43的mRNA水平治療組于傷后第3d達到峰值，之后隨著時間的延長急劇減

10、少，第21d基因水平極低，與對照組和正常組差異明顯(P＜0.01)；對照組于傷后第3d和正常組差異不明顯(P＞0.05)，之后隨時間延長急劇下降，第7d、14d與治療組和正常組差異明顯(P＜0.01)，第21d和治療組無差異(P＞0.05)和正常組差異明顯(P＜0.01)。
　　 5.嘌呤能受體P2X7的表達變化情況免疫熒光顯示P2X7的表達量于視神經(jīng)損傷后隨時間延長是逐漸增多的，但對照組的表達量明顯比治療組要高。P2X7的mR

11、NA水平變化情況：對照組的mRNA水平于損傷后第3d開始增高，但和正常組、治療組差異不明顯(P＞0.05)，第7d開始和正常組有差異(P＜0.05)，和治療組差異不明顯(P＞0.05)，之后急劇上升和治療組、正常組差異明顯(P＜0.01)；治療組于損傷后第3d、7d、14d和正常組差異不明顯(P＞0.05)之后開始上升，第21d和正常組有差異(P＜0.05)。
　　 6.促凋亡基因Bax、抑凋亡基因Bcl-2與Caspase-3

12、的表達情況免疫熒光顯示Bax的表達情況于視神經(jīng)損傷后對照組和治療組都隨時間延長逐漸增多，但對照組的表達量比治療組高；Bcl-2在對照組中第3d表達量很高，隨后逐漸降低，治療組于第3、7、14d表達都很高，第21d稍降低；Caspase-3于視神經(jīng)損傷后逐漸增多，但對照組的表達量要比治療組高；
　　 7.Tunel染色無論對照組還是治療組隨時間點凋亡細胞都逐漸增多，但治療組每個時間點下凋亡細胞都要比對照組少。
　　 結論：