SPIO及LV-GFP對TSCs標記的有效性和安全性分析.pdf

1、研究背景:
　　肌腱干細胞(TSCs)是來源于肌腱組織的一種具有高度增殖潛能、正常情況下分化為肌腱細胞的一種前體細胞,2007年Bi等首次從兔肌腱內(nèi)分離,并證實TSCs具有成骨、成脂、成軟骨等多向分化潛能,大量研究表明外源性TSCs有可能成為肌腱損傷和肌腱病細胞治療的重要手段。TSCs在體外的生物學行為變化及在體內(nèi)的定植和遷移變化是TSCs相關(guān)研究的核心問題之一;有效、安全的標記方法對所移植的TSCs進行示蹤對其相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究

2、至關(guān)重要。
　　國外有關(guān)TSCs的研究均集中于其分子生物學特性的相關(guān)研究,而對于其體內(nèi)移植的示蹤及觀察等臨床應(yīng)用研究尚無相關(guān)報道。目前干細胞標記方法較多,均存在各自的優(yōu)缺點。通過查閱大量文獻,我們發(fā)現(xiàn),SPIO、LV-GFP標記技術(shù)可能適合于TSCs的體內(nèi)外標記示蹤。結(jié)合SPIO可活體、無創(chuàng)示蹤,適用于臨床推廣的優(yōu)點,以及慢病毒(LV,Lentivirus)介導(dǎo)的GFP轉(zhuǎn)染示蹤操作簡便、成本低廉、熒光表達穩(wěn)定的優(yōu)點,本課題擬對SP

3、IO、LV-GFP標記TSCs方法的有效性、安全性進行探討。
　　目的:
　　1.在文獻報道基礎(chǔ)上,改進TSCs酶消化法,建立穩(wěn)定高效的TSCs分離、獲取方法;
　　2.探索SPIO及LV-GFP兩種細胞示蹤標記方法合適的標記條件,分析它們對TSCs標記的有效性和安全性,及其對TSCs生物學特性的影響;
　　3.觀察上述方法在體內(nèi)標記、示蹤的有效性;
　　通過本課題研究,擬為TSCs的體內(nèi)外示蹤提供有效和安

4、全的技術(shù)方法和理論支持。
　　方法:
　　1.在國外文獻報道的基礎(chǔ)上,將傳統(tǒng)酶消化-過濾法予以改進,不過濾而直接種植來分離、培養(yǎng)大鼠TSCs,并利用流式分析、免疫熒光、多向誘導(dǎo)分化等手段對該法獲取的TSCs進行鑒定。
　　2.采用葡聚糖包裹的SPIO和慢病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白兩種標記手段對TSCs進行標記,觀察SPIO濃度對TSCs標記有效率、體外標記后MRI檢測效率及其對TSCs的生長曲線的影響;
　　3.摸索

5、不同MOI值Lv-GFP對TSCs標記的有效率、體外標記傳代衰減情況、檢測其對TSCs干性的影響,選擇合最佳的MOI值。
　　4.建立大鼠跟腱急性斷裂模型,將示蹤標記的TSCs在損傷部位注射,于損傷早期(1周)及瘢痕重建后(6周)取材,觀察經(jīng)標記的TSCs在急性跟腱斷裂模型中的遷移、定植情況,證實該示蹤方法的有效性。
　　結(jié)果:
　　1.通過我們改進的TSCs酶消化法,一只實驗動物即可獲取4瓶原代細胞,較傳統(tǒng)酶消化-過

6、濾法,該法可多量、更穩(wěn)定的獲取原代細胞;該法提取的TSCs形態(tài)、克隆形成能力及增殖能力符合干細胞特征;Ⅰ型膠原、胚胎表面抗原SSEA4、Oct4表達陽性,Ⅲ型膠原表達陰性;干細胞表面標記物CD90、CD44呈陽性表達;CD34、CD106呈陰性表達;在體外誘導(dǎo)的情況下TSCs具有明確的成脂、成骨和成軟骨分化能力。
　　2.葡聚糖包裹的SPIO能夠標記TSCs,標記有效率隨SPIO濃度增大而增加,作用濃度達到8ug/ml時標記效率>

7、95％,細胞內(nèi)能夠有效觀察到鐵顆粒吞噬,但其對TSCs的增殖影響很大。
　　3.LV-GFP在體外能夠有效標記TSCs,標記有效率隨感染復(fù)數(shù)(MOI值)增加而增加,最佳MOI值為500,熒光強度值不隨體外傳代而減低,對成脂、成骨、成軟骨相關(guān)基因無明顯影響。
　　4.外源性TSCs經(jīng)過LV-GFP標記后,能夠在異體正常肌腱內(nèi)隨肌腱纖維的走行定植,在急性跟腱斷裂模型中定植于斷裂部位及形成的瘢痕中,超過6周仍能有效觀察。
　

8、　結(jié)論:
　　1.經(jīng)過我們改進的酶消化法分離、培養(yǎng)大鼠跟腱來源TSCs可靠、有效,能夠更多且穩(wěn)定的獲取TSCs;經(jīng)鑒定,該方法提取的TSCs具有明確的干細胞特性,有多向分化潛能。
　　2.葡聚糖包裹的SPIO雖然能夠可靠標記大鼠TSCs,但對其增殖能力影響過大,可能不適用于TSCs的標記示蹤,其他劑型的SPIO對TSCs標記特性仍有待進一步研究。
　　3.慢病毒介導(dǎo)的GFP在體外對TSCs示蹤標記有效可靠,標記有效率不