新型電紡取向納米紗-納米纖維三維組織工程纖維環(huán)支架的構(gòu)建.pdf

1、椎間盤突出術(shù)后復(fù)發(fā)與纖維環(huán)破損及無(wú)法有效修復(fù)密切相關(guān)。組織工程技術(shù)可望有效修復(fù)纖維環(huán)，理想的組織工程移植物不但能夠功能性替換受損的纖維環(huán)組織而且能夠促進(jìn)組織再生并恢復(fù)其應(yīng)有的生物學(xué)功能。如何根據(jù)纖維環(huán)特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織工程支架的構(gòu)建是制備修復(fù)材料的基礎(chǔ)。這些支架可以模擬體內(nèi)結(jié)構(gòu)提供人造的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境并為組織再生提供一個(gè)三維模板。靜電紡絲是目前構(gòu)建組織工程支架的一種經(jīng)濟(jì)而有效的手段。靜電紡絲生成的納米纖維在尺寸上和體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的纖維尺寸

2、相似。納米或微米級(jí)的纖維能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖和新陳代謝，有助于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。目前靜電紡絲已經(jīng)廣泛應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)組織工程研究領(lǐng)域。通常情況下，人們使用平板收集靜電紡絲纖維，從而獲得無(wú)規(guī)納米纖維支架，具有各向同性的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特點(diǎn)。然而在人體中承擔(dān)復(fù)雜應(yīng)力的纖維環(huán)組織，因其內(nèi)部膠原纖維的有序排列而具有明顯的各向異性力學(xué)特點(diǎn)。為模擬膠原纖維有序排列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，研究者提出很多方法來(lái)獲得有序排列的電紡纖維。最常見的方法是使用高速滾輪接收納米纖維。這

3、種方法制備的取向納米纖維支架具有各向異性的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特點(diǎn)，但由于纖維排列過于緊密，有礙細(xì)胞長(zhǎng)入，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。本研究先使用聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯為原料，構(gòu)建了取向納米纖維支架，了解該支架的特性和存在的問題。而后使用自行設(shè)計(jì)的新型半自動(dòng)靜電紡絲設(shè)備，構(gòu)建取向納米紗/納米纖維三維復(fù)合支架來(lái)模擬單層纖維環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。我們對(duì)這種新型支架的結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能進(jìn)行觀測(cè)，對(duì)支架內(nèi)細(xì)胞增殖和長(zhǎng)入情況進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果提示該支架具有良好的力學(xué)性能和細(xì)胞導(dǎo)入能力

4、，可用于纖維環(huán)組織工程的進(jìn)一步研究。
　　第一部分取向納米纖維組織工程纖維環(huán)支架的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　目的:以聚左旋乳酸聚己內(nèi)酯(P(LLA-CL))為原料，使用靜電紡絲技術(shù)構(gòu)建取向納米纖維支架。觀測(cè)其結(jié)構(gòu)，測(cè)試該支架力學(xué)性能，觀察細(xì)胞在支架上的粘附與增值情況，評(píng)估其應(yīng)用于纖維環(huán)組織工程研究的可行性。
　　方法:使用高速滾軸作為收集裝置構(gòu)建取向納米纖維支架，使用掃描電鏡觀察其表面結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使用拉伸力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)測(cè)試其拉伸力學(xué)性

5、能。體外接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察細(xì)胞在支架表面增殖和生長(zhǎng)情況。使用無(wú)規(guī)納米纖維支架作為對(duì)照進(jìn)行對(duì)比研究。
　　結(jié)果:制備的P(LLA-CL)取向納米纖維支架中納米纖維的排列具有良好的方向性，該支架在纖維排列方向上的拉伸力學(xué)強(qiáng)度得到明顯強(qiáng)化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在支架表面增殖，細(xì)胞可沿納米纖維方向拉伸并定向排列。
　　結(jié)論:取向納米纖維支架的力學(xué)強(qiáng)度在納米纖維排列方向上得到了增強(qiáng)，具有和單層纖維環(huán)板層相似的各向異性結(jié)構(gòu)和力學(xué)特

6、點(diǎn)，并能夠誘導(dǎo)細(xì)胞沿纖維方向定向排列，可作為纖維環(huán)組織工程研究的備選支架。
　　第二部分新型取向納米紗/納米纖維組織工程纖維環(huán)三維支架的構(gòu)建及驗(yàn)證
　　目的:模擬椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使用改進(jìn)的新型半自動(dòng)靜電紡絲設(shè)備，構(gòu)建由取向納米紗和無(wú)規(guī)納米纖維構(gòu)成的復(fù)合三維支架，觀察該支架的結(jié)構(gòu)和力學(xué)特點(diǎn)，觀察支架與細(xì)胞之間的相互作用，評(píng)估其應(yīng)用于纖維環(huán)組織工程研究中的價(jià)值。
　　方法:使用自行改進(jìn)的半自動(dòng)雙接收裝

7、置靜電紡絲設(shè)備制備了取向納米紗/納米纖維組織工程三維支架（ANYNFS）。使用聚左旋乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(P(LLA-CL))和絲素蛋白(SF)為原料進(jìn)行支架構(gòu)建，使用同種原料制備無(wú)規(guī)納米纖維支架（RNFS）和取向納米纖維支架(ANFS)進(jìn)行對(duì)比研究。使用掃描電鏡觀察支架的表觀特征;使用透射電鏡觀察支架內(nèi)部結(jié)構(gòu);使用材料力學(xué)性能顯微測(cè)試系統(tǒng)對(duì)支架進(jìn)行單軸拉伸力學(xué)測(cè)試。將大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)種植于支架表面，使用掃描電鏡和共聚

8、焦顯微鏡觀察細(xì)胞的粘附、增殖情況。使用雙鏈DNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞在三種支架上的增殖速率;使用組織切片對(duì)支架內(nèi)細(xì)胞長(zhǎng)入情況進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:使用新型電紡設(shè)備構(gòu)建的ANYNFS由取向排列的納米紗和無(wú)規(guī)分布的納米纖維構(gòu)成，具有三維空間結(jié)構(gòu)。與RNFS和ANFS相比，該支架具有更大的孔徑和更高的孔隙率。拉伸力學(xué)結(jié)果顯示，ANYNFS的力學(xué)強(qiáng)度在平行于取向納米紗排列的方向上得到了明顯的增強(qiáng)，具有各向異性的力學(xué)特點(diǎn)。雙鏈DNA檢測(cè)試劑盒

9、檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大鼠BMSCs在ANYNFS中增殖速率要明顯高于RNFS和ANFS，即ANYNFS更有利于細(xì)胞增殖。掃描電鏡和共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn):細(xì)胞在RNFS表面隨機(jī)分布，在ANFS表面沿著取向納米纖維方向定向拉伸并有序排列，在ANYNFS中，部分細(xì)胞沿著納米紗拉伸并有序排列，部分細(xì)胞隨機(jī)排列。組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可長(zhǎng)入ANYNFS內(nèi)部。而在RNFS和ANFS中，細(xì)胞僅能在支架表面二維生長(zhǎng)，無(wú)法長(zhǎng)入支架內(nèi)部。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的

10、新型三維SF/P(LLA-CL)取向納米紗/納米纖維復(fù)合支架比無(wú)規(guī)納米纖維支架和取向納米纖維支架有更大的孔徑和更高的孔隙率。該支架能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖，引導(dǎo)細(xì)胞有序排列。該支架的力學(xué)強(qiáng)度在平行于納米紗方向得到了增強(qiáng)，有良好的力學(xué)性能和各向異性的力學(xué)特點(diǎn)，能夠模擬單層纖維環(huán)的細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)并具有相似的力學(xué)性能。該支架具有良好的三維結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞長(zhǎng)入支架內(nèi)部，達(dá)到三維培養(yǎng)細(xì)胞的效果。該支架在保證力學(xué)強(qiáng)度的同時(shí)提供了較高的孔隙率，非常適合纖