間充質祖細胞源性神經元樣細胞體內移植延緩骨骼肌萎縮的實驗研究.pdf

1、外周神經損傷后骨骼肌發(fā)生嚴重萎縮抑或損傷神經修復后肌肉功能難以恢復的患者在臨床上較為常見，并且治療相當困難。深入闡明失神經性骨骼肌萎縮的機理，有效地延緩或防治其萎縮，最大程度地維持骨骼肌原有功能，是近年來研究的重點和亟待解決的難題。顯微外科技術的廣泛應用盡管能提高外周神經損傷的修復水平，但術后骨骼肌功能恢復并不十分理想，其根源在于周圍神經損傷后，運動神經再生非常緩慢，當受損神經通過再植或重新長入所支配的靶肌肉時，長時間失神經支配所致的肌

2、肉不可逆變化（如肌肉萎縮、纖維化等）使骨骼肌無法恢復正常功能。為防治失神經性骨骼肌萎縮，國內外學者采取了許多方法，包括功能性電刺激、被動運動、藥物療法、神經元植入、生長因子治療、基因治療等，盡管實驗研究均取得了一定成功，但臨床應用的療效卻有限。
　　干細胞(stem cell，SC)是一類具有自我增殖能力與多向分化潛能的細胞，既能產生基因型與自己完全相同的子代細胞，也能分化為祖細胞，具有再生為各種組織、器官的潛能，故醫(yī)學界稱其為“

3、萬用細胞”?！把芯勘砻?，成體干細胞(adult stem cells，ASCs)在自然條件下通常傾向于分化為所屬組織的各種細胞類型，主要用于替換衰老死亡的細胞和維持機體新陳代謝的相對穩(wěn)定，但在特定的外界誘導條件下，一種組織的成體干細胞可以“橫向分化”為其他組織的功能細胞，參與組織的損傷修復。此外，成體干細胞還可取自于患者的自身組織，通過定向誘導分化后重新植入患者體內避免了免疫排斥的問題。正是由于成體干細胞具有可塑性、旺盛的自我增殖能力及

4、多向分化潛能，且疾病或損傷均能刺激成體干細胞的增殖和分化，因此一些學者認為成體干細胞對于各種神經系統(tǒng)損傷將是一種重要的治療措施，并具有廣闊的應用前景。
　　近年來，一些學者將神經干細胞(neural stem cells，NSCs)及間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植于離斷的外周神經或直接注入靶肌肉內并有效延緩了失神經性骨骼肌萎縮，動物實驗確實獲得了成功，但由于足量的神經干細胞獲得途徑相對有

5、限且擴增困難，體外培養(yǎng)的小鼠間充質干細胞又極易遭受到造血干細胞的污染而使其增殖效果不理想，尋找新的移植細胞尤為迫切。新近研究發(fā)現(xiàn)，間充質祖細胞(mesenchymal progenitor cell，MPCs)可體外定向誘導分化為神經元樣細胞，同時間充質祖細胞具有易獲取、易生長、增殖能力強等特點，且來源于密質骨，體外培養(yǎng)時可避免造血干細胞的污染，故有望成為神經干細胞及間充質干細胞的替代種子細胞。
　　因此，本課題擬培養(yǎng)GFP轉基因

6、C57小鼠密質骨碎片來源MPCS，體外定向誘導分化為神經元樣細胞后進行神經斷離處移植或直接注入靶肌肉內，初步探討移植細胞體內原位定植存活情況以及延緩骨骼肌萎縮的作用與機制，為進一步探明其分子機制、后期臨床應用提供理論指導和實驗依據(jù)，同時也為法醫(yī)物證學的個體識別方法、神經損傷后鑒定時限及其損傷程度的把握提供了新的思路。
　　本研究內容主要包括兩部分:
　　第一部分:間充質祖細胞源性神經元樣細胞肌內移植后自身特性的維持。

7、　　目的:
　　體外培養(yǎng)綠色熒光蛋白轉基因C57小鼠密質骨碎片來源的間充質祖細胞，通過體外定向誘導分化為神經元及神經膠質樣細胞后移植于神經斷離處及直接注入靶肌肉中，探討肌內移植后能否定植存活并維持其移植前的特性。
　　方法:
　　取3周齡健康GFP轉基因C57小鼠后肢長骨進行MPCs培養(yǎng)，利用流式細胞術及成骨、成脂定向誘導分化檢測其純度及多向分化潛能。選取生長良好的第三代MPCs，神經元原代培養(yǎng)上清液進行神經元及神經膠

8、質樣細胞誘導分化后，采用免疫熒光染色檢測神經元特異性標志物NSE、NeuN及神經膠質特異性標志物GFAP的表達情況并收集細胞，用生理鹽水調整細胞濃度至5×105/μl細胞懸液備用;選取12周齡健康C57小鼠24只，按隨機數(shù)字表法分為神經斷離處+MPC移植組、神經斷離處+生理鹽水組、肌肉+MPC移植組、肌肉+生理鹽水組，其中上述各組小鼠右后肢作為實驗側，左后肢為假手術側。參照文獻操作方法，4組小鼠右后肢均切斷坐骨神經建立小鼠失神經腓腸肌萎

9、縮模型，左后肢儀分離坐骨神經但不做切斷處理。神經斷離處+MPC移植組和肌肉+MPC移植組:右側坐骨神經切斷處、右側腓腸肌內及左側對應部位分別注入5μl MPCs懸液;神經斷離處+生理鹽水組和肌肉+生理鹽水組:右側坐骨神經切斷處、右側腓腸肌內及左側對應部位均注入5μl生理鹽水。術后4周，熒光顯微鏡下觀察肌內移植細胞存活情況，并采用免疫熒光染色檢測移植細胞神經元特異性標志物NSE、NeuN及神經膠質特異性標志物GFAP的表達情況。
　

10、　結果:
　　1、通過小鼠密質骨培養(yǎng)獲得的MPCs主要表達間質細胞免疫表型CD29、CD44、CD90、CD106，不表達造血干細胞免疫表型CD31和CD45，且在體外能夠誘導分化為骨細胞及脂肪細胞，提示通過小鼠密質骨培養(yǎng)獲得的MPCs是細胞同源性好、純度高、排除了造血干細胞干擾且具有多向分化潛能的成體干細胞。
　　2、MPCs經神經元原代培養(yǎng)上清液誘導24 h后，大部分細胞陽性表達NSE、NeuN，少數(shù)細胞陽性表達GFAP

11、，而對照組未見確切陽性表達細胞，提示MPCs經體外定向誘導分化后具備神經元或神經膠質的某些特性。
　　3、術后4周，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)移植細胞均勻分布于肌細胞間隙;免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，神經斷離處+MPC移植組和肌肉+MPC移植組右后肢注射部位周圍肌肉組織中大部分移植細胞陽性表達NSE、NeuN，少量細胞陽性表達GFAP，而左側對應部位肌肉組織以及另外兩組均未見明顯陽性細胞表達，提示MPCs源性神經元樣細胞移植于神經斷離處及失神經支

12、配靶肌中能夠定植存活并很好地維持其移植前特性。
　　結論:
　　1、成功培養(yǎng)出生長良好、純度高且具有多向分化潛能的MPCs細胞。
　　2、MPCs體外可定向誘導分化為神經元及神經膠質樣細胞。
　　3、MPCs源性神經元樣細胞肌內移植后能夠在原位定植存活并很好地維持其移植前特性。
　　第二部分:間充質祖細胞源性神經元樣細胞體內移植延緩骨骼肌萎縮的研究
　　目的:
　　初步探討間充質祖細胞源性神經元

13、樣細胞移植于神經斷離處和靶肌肉中延緩失神經性骨骼肌萎縮作用及其機制。
　　方法:
　　取GFP轉基因C57小鼠后肢長骨進行MPCs培養(yǎng)及鑒定，選取生長良好的第三代MPCs，采用神經元原代培養(yǎng)上清液進行神經元及神經膠質樣細胞誘導分化后收集細胞，生理鹽水調整細胞濃度至5×105/μl細胞懸液備用。選取C57小鼠48只，隨機分為對照組、神經斷離組、神經斷離處移植組、肌肉移植組，每組12只。參照文獻操作方法，建立小鼠失神經腓腸肌萎縮

14、模型，其中對照組不做任何處理。神經斷離處移植組和肌肉移植組分別于坐骨神經斷離處、腓腸肌內注入5μl MPCs懸液，神經斷離組于腓腸肌內注入等量生理鹽水，對照組不作任何處理。觀察小鼠后肢活動能力，術后2和4周測量腓腸肌濕重、肌纖維橫截面積維持率及觀察超微結構，用Western blot檢測α-actin、MHC及RT-PCR檢測Myogenin、MyoD的表達情況。
　　結果:
　　1、術后2和4周，神經斷離處移植組和肌肉移植

15、組腓腸肌濕重及肌纖維橫截面積維持率顯著高于神經斷離組，提示兩種治療方法均可有效延緩失神經性骨骼肌萎縮，其中神經斷離處移植組治療效果更顯著。
　　2、術后4周，神經斷離處移植組和肌肉移植組肌細胞核、線粒體、內質網(wǎng)的退變及肌肉纖維化程度明顯低于神經斷離組，且部分細胞表現(xiàn)出旺盛的增殖活性的特點（細胞核內移，核增大，核仁明顯，異染色質發(fā)達、線粒體數(shù)量增多等），表明兩種治療方法均可有效抑制失神經性骨骼肌纖維化;
　　3、術后4周，We

16、stern blot檢測發(fā)現(xiàn)，神經斷離處移植組和肌肉移植組腓腸肌內α-actin及MHC的表達程度均顯著高于神經斷離組和對照組，表明兩種治療方法既可有效抑制失神經性骨骼肌蛋白質的降解，又能夠促進蛋白質的加快合成。
　　4、術后4周，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，神經斷離處移植組和肌肉移植組腓腸肌內Myogenin及MyoD的基因表達豐度顯著高于神經斷離組和對照組，其中以MyoD的高表達更為顯著。
　　結論:
　　1、MPCs源