穩(wěn)定表達乙型腦炎病毒NS2B-NS4B細胞系的構建及其在篩選互作蛋白中的初步應用.pdf

1、日本乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬，是一種典型的嗜神經病毒。該病毒豐要經蚊蟲傳播，并嚴重危害人、畜健康。人類發(fā)病后死亡率高，且治愈后往往留下神經學后遺癥。在豬群中，該病毒主要引起妊娠母豬流產、產死胎或木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱等，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。
　　NS2B和NS4B蛋白是JEV的2個重要的非結構蛋白，它們的

2、功能尚待解答。本研究旨在構建能穩(wěn)定表達NS2B和NS4B蛋白的細胞系，并在此基礎上，通過串聯親和層析（Tandem Affinity Purification，TAP）與質譜(Mass spectrometry analysis，MS)技術，篩選可能與它們相互作用的宿主蛋白，從而為深入闡明NS2B和NS4B的功能及其與宿主細胞相互作用機制的研究奠定基礎。
　　具體研究內容如下:
　　1.構建細胞系
　　利用RT-PCR

3、方法擴增JEV NS2B和NS4B基因，并將之克隆至帶嘌呤霉素(Puromycin)抗性基因的載體Psin-EF2-MCS-Pur中。然后利用慢病毒載體包裝系統，與psPAX2和pMD2.G共同轉染293T細胞，收獲的慢病毒粒子轉導正常293T細胞，通過嘌呤霉素篩選純化細胞系Cellline-NS2B和Cellline-NS4B。同時，用空載體包裝病毒，相同方法獲得對照組細胞系Cellline-vector。
　　2.細胞系的驗證

4、
　　對已經得到的慢病毒細胞系，采用三種方式進行驗證:嘌呤霉素抗性實驗;免疫熒光染色;Western blot驗證。三種方法都證明了細胞系中目的蛋白能穩(wěn)定、高效表達。
　　3.篩選互作蛋白
　　利用建立的細胞系，進行串聯親和層析實驗，洗脫后的產物進行SDS-PAGE膠分離并進行銀染處理，分析實驗組和對照組產物條帶的區(qū)別，并結合質譜分析的方法找出在293T細胞中與JEV NS2B和NS4B蛋白相互作用的宿主蛋白質。最終我