大鼠間充質干細胞對小鼠黑色素瘤影響的實驗研究.pdf

1、目的:惡性黑色素瘤(malignantmelanoma,MM)來源于黑色素細胞，是一種惡性程度較高的具有黑色素細胞分化的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的1％～2％，大部分發(fā)生于皮膚[1-2]，其次為直腸、肛門、生殖道、消化道、鼻竇、喉、肺等，也可發(fā)生于脈絡膜及軟腦膜處[3-5]。惡性黑色素瘤占皮膚腫瘤的7％～20％，近年來其發(fā)生率呈明顯增高趨勢。與黑色素瘤發(fā)生的相關因素有遺傳、紫外線、色素痣等。因惡性黑色素瘤病理組織學和細胞學形態(tài)的多樣性，部

2、分腫瘤不含黑色素，容易誤診和漏珍。目前的治療方法常采用手術、生物、放療及化療，但效果不甚理想。因此尋求療效好、副作用小的治療方法是當下研究的熱點問題。
　　 間充質干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)最早從骨髓中分離發(fā)現的，具有塑料貼壁性，呈纖維狀，能夠在體內外分化為脂肪細胞、成骨細胞及軟骨細胞，也可向其它生殖系統(tǒng)分化。由于MSCs具有多潛能的分化特性，最早是用來修復組織。近年來研究表明，它還具有抗增殖和

3、抗炎癥的作用，同時還具有很好的遷移能力和腫瘤趨向性。在腫瘤生長的微環(huán)境中，腫瘤細胞及其周圍的纖維基質可分泌各種細胞因子，能促進MSCs向腫瘤部位遷移集聚、增殖分化，進而影響腫瘤的生長。因此，關注和研究MSCs對腫瘤微環(huán)境的影響，MSCs用于臨床抗腫瘤治療研究方面有著重要的作用。
　　 方法:
　　 1、用密度梯度離心法分離并純化大鼠的骨髓間充質干細胞，并且將MSCs細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素10

4、0U/ml，含鏈霉素100U/ml，PH7.2）中，放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　 2、通過誘導，讓所得到的間充質干細胞通過向成骨細胞和神經元樣細胞分化，來驗證其作為干細胞具有多向分化的潛能。
　　 3、將B16惡性黑色素瘤細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含青霉素100U/ml，含鏈霉素100U/ml，PH7.2）中，放入37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱內進行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　

5、4、黑色素瘤動物模型的制備:將小鼠黑色素瘤細胞B16向小鼠后肢皮下注射，制備黑色素瘤動物模型。
　　 5、動物模型制備完成后，隨機將小鼠分為A（對照組）、B（實驗組）兩組，每組6只。
　　 6、動物實驗A組小鼠注射生理鹽水，B組小鼠注射間充質干細胞。讓小鼠自由進食水，觀察并記錄腫瘤的生長情況。
　　 7、間充質干細胞移植兩周后將小鼠全部處死，取下A、B兩組小鼠的腫瘤，做常規(guī)組織病理檢查。
　　 8、統(tǒng)計學

6、分析運用統(tǒng)計學軟件SPSS對數據進行統(tǒng)計分析。
　　 結果:
　　 1、以密度梯度離心法分離純化的細胞，可逐步得到呈長梭形放射狀排列的細胞。
　　 2、通過誘導，所得到的間充質干細胞可以向成骨細胞以及神經元樣細胞分化。
　　 3、經皮下注射小鼠黑色素瘤細胞B16的小鼠，1周后成瘤，2周時腫瘤明顯增大，小鼠活力正常。
　　 4、間充質干細胞移植兩周后，小鼠活力正常，并將小鼠全部處死。A組小鼠部分腫瘤

7、組織的頂端出現不同程度的破潰。B組小鼠未見明顯異常。
　　 5、A組（對照組）小鼠腫瘤組織直徑平均長度0.28cm，平均寬度0.18cm，平均濕重0.65g;B組（實驗組）小鼠皮下脂肪基本消失，腫瘤直徑長度平均直徑2.35cm，平均寬度0.71cm;平均濕重7.90g，部分腫瘤組織的頂端出現不同程度的破潰及出血。
　　 6、A組（對照組）顯微鏡下觀察:大部分、真皮的結構正常，大量腫瘤細胞已侵襲真皮以下組織。腫瘤細胞大小不

8、一，較大，染色深，呈紫黑色，可見較多核分裂。部分區(qū)域腫瘤組織密集排列，有成巢傾向，其周圍可見纖維組織間隔，血管分布少，腫瘤細胞呈多角形;部分腫瘤組織呈彌漫性分布，腫瘤間質少，血管豐富，腫瘤細胞較大，呈圓心或橢圓形。腫瘤組織間血管豐富，管腔擴張，內充滿紅細胞，腫瘤組織密集排列區(qū)域，部分腫瘤細胞已侵入血管壁，管壁破壞，進入管腔內。間質可見淋巴細胞、中性粒細胞、漿細胞，有脂肪壞死。B（實驗組）組顯微鏡下觀察:腫瘤組織已侵入表皮下，接近基底膜帶

9、，核分裂象多見。腫瘤組織間血管數量明顯增多，血管直徑明顯增大。炎細胞與A組（對照組）相比可見淋巴細胞（較多）、中性粒細胞（中量）、漿細胞（少）?？梢娸^多脂肪壞死。
　　 7、B組小鼠腫瘤平均重量7.90g、腫瘤平均體積0.659mm3，與A組小鼠腫瘤平均重量0.65g、腫瘤平均體積0.009mm3相比有明顯差異，統(tǒng)計分析P＜0.001，具有統(tǒng)計學意義。
　　 結論:
　　 1、腫瘤體積明顯增大，重量明顯增加，MS