哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2在白介素-35介導T淋巴細胞增殖抑制中的作用及機制.pdf

1、目的:1.闡明白介素-35(interleukin-35，IL-35)作為免疫調節(jié)因子，對T淋巴細胞增殖效應的可能影響。2.探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2(mTORC2)在IL-35影響細胞增殖效應中的作用。3.明確mTORC2在IL-35影響細胞增殖中的確切意義及作用機制，為探索膿毒癥免疫調控途徑提供新線索。
　　方法:以Jurkat細胞作為人T淋巴細胞模型。10％ FBS-RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度至

2、1×105/ml，取1 ml/孔接種于12孔培養(yǎng)板，采用不同濃度IL-35(10、50、250 ng/ml)于不同時間點(12、24、48 h)予以刺激，刺激前6h予以PMA(50 ng/ml)和Ionomycin(1μM)輔助活化。實驗一:采用IL-35刺激后，CCK法檢測細胞增殖活性，分析時間/劑量效應關系;流式細胞術檢測細胞周期分布，明確IL-35抑制T淋巴細胞增殖反應的方式。實驗二:采用Westernblot(WB)法及熒光共聚

3、焦法檢測隨IL-35刺激劑量的增加，mTORC2核心組分mTOR、Rictor蛋白表達及其下游信號通路蛋白SGK1、p27變化情況，籍以分析mTORC2在IL-35介導T淋巴細胞增殖抑制中的作用。實驗三:應用慢病毒轉染的方法對mTORC2關鍵組分Rictor進行調節(jié)，構建細胞模型，進而再次應用CCK法對IL-35影響下的細胞增殖情況以及應用WB法對mTOR、SGK1、p27蛋白表達情況進行檢測，籍以分析mTORC2及其下游信號蛋白SGK

4、1、p27在IL-35介導T淋巴細胞增殖抑制中的關鍵作用與調控環(huán)節(jié)。
　　結果:1.當IL-35劑量達到50 ng/ml和250 ng/ml、刺激12 h后，與對照組比較即呈現(xiàn)明顯的增殖抑制現(xiàn)象(P＜0.05）;而10 ng/ml組在刺激時間達24 h和48 h時，Jurkat細胞增殖活性也顯著下降（P＜0.05）。流式細胞術結果顯示，在IL-35作用下，與對照組相比，更多的細胞停留在G0/G1期(50 ng/ml及250 ng/

5、ml組，P＜0.05)。2.WB結果顯示，單獨P/I活化的T淋巴細胞會引起mTOR、Rictor、SGK1、p27的磷酸化水平增加(P-mTOR Ser2481，P-Rictor Thr1135，P-SGK1Ser422，P-p27 T157; P＜0.05); IL-35作用下，隨劑量的增加，與活化對照組相比，各組蛋白磷酸化水平呈下降趨勢(P＜0.05)，而各組非磷酸化蛋白水平無明顯差異（P＞0.05）;共聚焦顯微鏡結果驗證了上述變化

6、趨勢。3.設計Rictor Thr1135突變慢病毒，構建細胞模型并采用WB驗證Rictor表達良好后，檢測IL-35作用下模型細胞的增殖及蛋白表達情況。結果顯示，干擾Rictor磷酸化位點以后，IL-35介導T淋巴細胞增殖抑制效應顯著下降;同時mTORC2核心組分蛋白mTOR及其下游信號通路蛋白SGK1，p27其磷酸化水平與對照組無明顯差異。
　　結論:1.IL-35能夠以時間/劑量依賴特性對T淋巴細胞增殖產生抑制作用，其效應的