抗菌性骨缺損修復材料的理化與生物學性能實驗研究.pdf

1、最為理想的生物材料就是機體自身的組織,天然生物材料經(jīng)過億萬年的演變進化,形成具有結(jié)構(gòu)復雜精巧、效能奇妙多彩的功能原理和作用機制。新鮮自體骨是由無機材料和有機材料巧妙地結(jié)合在一起形成的復合體,其中無機材料的大部分是羥基磷灰石結(jié)晶,具有較高的骨誘導性,無免疫排斥反應,但是會增加手術創(chuàng)傷,并且病人還會出現(xiàn)局部疼痛、感覺異常或過敏等并發(fā)癥,骨的來源也十分有限。近年來,利用組織工程化骨修復骨缺損,不僅提供了一種修復骨缺損的方法,而且也提供了一種全

2、新思路,骨組織工程學的研究為治療骨缺損帶來了新的希望。目前,體外構(gòu)建的組織工程化人工骨雖然還停留在實驗室及動物實驗階段,但隨著細胞生物學、工程學、免疫學、材料學等相關學科的發(fā)展,骨組織工程學的研究也將會取得突破性進展,在工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應用上有著極其廣闊的應用前景,它將會成為21世紀極具發(fā)展?jié)摿Φ母咝录夹g產(chǎn)業(yè),蘊藏著巨大的經(jīng)濟與社會效益。作為人類骨組織的主要無機成分,羥基磷灰石生物陶瓷價廉易得,具有良好的生物相容性,可降解又具備骨引導、

3、骨融合性,尤其是含孔的珊瑚羥基磷灰石可提供很大的表面積/體積比,能保證細胞的增殖、分化和高代謝活動,所以特別適合用于骨組織工程。隨著現(xiàn)代工業(yè)化機械化程度的提高,由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤、事故、戰(zhàn)爭、地震等所致的大量污染性骨缺損發(fā)生率大幅度升高。對其傳統(tǒng)治療方法,即先清創(chuàng)、待傷口關閉、無感染跡象3～6個月后、再行二期植骨修復；而一期植骨常因發(fā)生較高的感染率而被視為禁忌,且臨床上細菌耐藥性的問題日益嚴重,植骨材料加載抗生素的作用越來越局限化,對

4、抗菌劑提出了更高的要求。為解決傳統(tǒng)治療方法所帶來的增加治療時間、難度、患者的痛苦和經(jīng)濟負擔等一系列問題,改變傳統(tǒng)觀念,近年來,國內(nèi)外學者在抗菌骨移植材料的基礎實驗和臨床實踐方面進行了大量的研究,取得了一定的進展。為此,我們研制一種抗菌性骨支架修復材料,并經(jīng)以下系列實驗研究證明:這一抗菌性骨修復材料具有良好的生物相容性,可在局部緩釋銀離子,有效地抑制污染性骨缺損清創(chuàng)術后局部殘留的細菌。
　　 實驗分四個部分進行觀察研究:
　

5、　 課題研究第一部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨的制備及性能表征。
　　 目的:制備載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨并觀察其理化性能表征。
　　 方法:實驗于2008-05/08在清華大學材料科學與工程系實驗室完成。實驗材料:在加工好的珊瑚羥基磷灰石(Coral Hydroxyapatite,CHA)顆粒與相應濃度硝酸銀(Silver nitrate,AgNO3)溶液浸泡一定時間后置入凍干機凍干制得載銀珊瑚羥基磷灰石(Silve

6、r-loaded Coral Hydroxyapatite,SLCHA或Ag+-CHA)。應用X射線衍射法對Ag+-CHA、CHA和純珊瑚樣品晶體的物相、結(jié)構(gòu)和位相進行分析；應用FT-IR光譜法對樣品的材料組成進行分析；應用掃描電鏡觀察材料的顯微形貌和孔徑；利用壓縮試驗及三點彎曲試驗評價骨修復支架材料的機械性能。應用SPSS13.0軟件對機械性能測試結(jié)果行單向方差分析及LSD法兩兩比較(α=0.05)。
　　 結(jié)論:珊瑚羥基磷灰

7、石經(jīng)載銀后未改變其理化性能,依然維持著三維多孔框架結(jié)構(gòu)；制備原理主要為鈣銀離子之間的置換反應,其次為銀離子的溶出-沉積反應,并且隨著制備過程中硝酸銀溶液濃度的遞增,Ag+-CHA的載銀量也隨之遞增。
　　 課題研究第二部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨的載銀量及體外緩釋實驗研究
　　 目的:研制載銀珊瑚羥基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,通過對其自身載銀量及體外緩釋實驗完善對該抗菌性磷灰石類復合人工骨的認識。
　　 方法

8、:應用電感耦合等離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma opticalemission spectrometry,ICP-OES)測定載銀材料中銀的平均含量,并在模擬體液(Stimulated body fluid,SBF,pH=7.25)中通過體外釋放試驗測定銀離子釋放濃度與時間的變化曲線,探討材料結(jié)構(gòu)與釋放銀的關聯(lián)性。實驗數(shù)據(jù)應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理,用相關回歸分析和曲線擬合載銀量與AgNO3濃

9、度關系曲線,建立回歸方程。
　　 結(jié)論:載銀珊瑚羥基磷灰石之所以能保持長時間的銀離子釋放,與羥基磷灰石本身的空間晶格結(jié)構(gòu)關系密切,這種可逆的離子置換過程使其釋放性能更顯著,能更有效地避免銀離子突釋,保持長時間的持續(xù)釋放,有效地減少金屬銀的使用量,達到減毒增效的作用。
　　 課題研究第三部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨的細胞相容性研究
　　 目的:研制載銀珊瑚羥基磷灰石抗菌性人工骨支架材料,觀察其在體外與小鼠胚胎成骨

10、細胞株(MC3T3-E1)的細胞相容性。
　　 方法:實驗于2009-06/09在廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院實驗科完成。采用體外細胞培養(yǎng)技術,將MC3T3-E1細胞種植于10-3、8×10-5、10-5 mol/L,Ag+-CHA,CHA及純珊瑚支架材料上。實驗評估:①MTT法測定MC3T3-E1細胞接種在不同支架材料上生長1,3,5d后的吸光光度值,繪制細胞在不同骨材料上的生長曲線,評價材料上細胞的增殖情況；②堿性磷酸酶(ALP)活性

11、法測定細胞接種在不同支架材料上2,4,6d的吸光光度值,計算培養(yǎng)液中堿性磷酸酶值；③倒置相差顯微鏡下直接觀察培養(yǎng)板上MC3T3-E1細胞的生長形貌；④應用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscopes,CLSM)直接觀察支架材料上MC3T3-E1細胞的生長形貌；⑤應用掃描電鏡(SEM)觀察細胞在材料上生長的微觀形貌。應用SPSS 13.0軟件對各框架材料上的細胞生長情況結(jié)果行析因方差分析及LSD

12、法兩兩比較,(α=O.05)。
　　 結(jié)論:通過MTT、ALP活性、倒置相差顯微鏡、激光共聚焦及掃描電鏡全方位多角度觀察了細胞在天然框架材料上的反應。細胞增殖、生長良好,表明材料具有良好的細胞相容性。MTT、ALP活性的定量結(jié)果表明低載銀量珊瑚羥基磷灰石材料與非載銀骨替代材料的生物相容性基本一致。
　　 課題研究第四部分:載銀珊瑚羥基磷灰石人工骨修復兔橈骨污染性骨缺損的實驗研究
　　 目的:通過體內(nèi)動物實驗檢測該

13、抗菌性人工骨植入動物體內(nèi)的組織相容性、骨傳導性和材料的生物降解等組織自愈合生物學性能。
　　 方法:新西蘭大白兔36只,隨機分為4組,每組9只。選用新西蘭大白兔制作兔橈骨15mm節(jié)段性污染性骨與骨膜缺損模型,將36只大白兔稱重,按體重大小順序編號,按隨機數(shù)目表法隨機分為A～D組。A組植入載銀珊瑚羥基磷灰石材料；B組植入珊瑚羥基磷灰石材料；C組植入原位自體骨材料；D組無任何植入,做為對照組。分別于術后2,6,10周分三次處死動物取

14、材,每次每組3只,通過大體觀察、影像學檢查、組織學檢查觀察比較各組骨缺損修復情況,應用SPSS13.0軟件對X線觀察結(jié)果行重復測量方差分析及LSD法兩兩比較,α=0.05,比較上述各組對大段骨缺損的修復作用。
　　 結(jié)果:不同組材料對骨缺損修復的大體觀察結(jié)果可見2w時A、B兩組移植物表面有肉芽組織和部分半透明骨質(zhì)覆蓋,與宿主骨斷端間有部分骨痂連接,移植物無明顯移位；C組移植物與宿主骨有部分骨痂連接,移植物無活動；D組骨缺損區(qū)填充

15、以肌纖維組織。6w時A、B兩組移植物表面有薄層骨質(zhì)覆蓋,與宿主骨斷端間有大量骨痂連接,較穩(wěn)固；C組移植物與宿主骨皮質(zhì)連續(xù),但不均勻,移植物無明顯移位；D組缺損區(qū)仍填充以肌纖維組織。10w時A、B兩組移植物表面有明顯連續(xù)骨質(zhì)覆蓋,移植物穩(wěn)固；C組移植物與宿主骨皮質(zhì)連續(xù)成一體；D組缺損區(qū)仍填充以肌纖維組織。X線檢查結(jié)果可見不同時間點各組之間比較有顯著性差異(F=11.537,P=0.000)；自體骨成骨情況最好,與其他各組之間比較有顯著性差

16、異(P值分別為0.004、0.010、0.000),說明自體骨組織在大段骨缺損修復時仍然是最好的材料；Ag+-CHA組與CHA組兩組比較無顯著性差異(P 值分別為0.524),說明珊瑚羥基磷灰石經(jīng)一定量載銀后其成骨作用未受明顯影響；對照組與其他各組之間比較有顯著性差異(P=0.000、0.000、0.000),說明污染性兔橈骨大段骨缺損后其成骨作用明顯受到抑制,其模型制作是成功的。
　　 結(jié)論:根據(jù)仿生的思路和以往對骨修復框架材

17、料的研究,我們制備了一種新型的抗菌性框架材料用于污染性骨缺損修復。此材料成分和結(jié)構(gòu)均與天然骨無機成分有相似性,多孔結(jié)構(gòu)與松質(zhì)骨類似。通過體內(nèi)動物實驗,證明了此材料具有良好的生物相容性和骨傳導性,是有效的骨修復框架材料,可以達到與自體骨材料相同的效果,有希望成為污染性骨缺損修復的優(yōu)選材料,具有廣闊的市場前景。
　　 綜上所述,抗菌性載銀珊瑚羥基磷灰石骨替代材料的制備過程簡單,抗菌劑銀離子的緩釋性能較為理想,在污染性大段骨缺損處有良