基于轉錄組測序篩選及克隆棉花抗黃萎病相關基因.pdf

1、棉花黃萎病嚴重影響棉花的產(chǎn)量和品質，阻礙了我國棉花的生產(chǎn)發(fā)展。隨著分子生物學和基因工程的快速發(fā)展，利用生物技術研究棉花抗黃萎病機制和克隆與棉花抗黃萎病相關基因已經(jīng)成為當前研究熱點。本研究利用本課題已構建的黃萎病菌誘導的棉花轉錄組數(shù)據(jù)庫，結合在棉花D基因組中鑒定的抗病R基因篩選出與棉花抗黃萎病相關的候選抗病基因，并通過熒光定量PCR分析其在黃萎病菌誘導后的表達趨勢。從候選抗病基因中選擇兩個GbDRP66319和GbHIR42734進行基因

2、克隆、生物信息學分析，并通過VIGS技術初步驗證其功能。研究結果如下：
　　1、在本課題已經(jīng)獲得與棉花抗黃萎病性狀顯著關聯(lián)的分子標記兩端800kb范圍內尋找含有NBS-LRR類R基因共64個，以R基因比對黃萎病菌誘導的轉錄組數(shù)據(jù)庫，獲得與之高度同源的Unigenes，從中選擇顯著差異表達的24個Unigenes進行熒光定量PCR，其在黃萎病菌誘導后的表達趨勢，結果顯示黃萎病菌誘導后相比對照表達量總體呈上調，但是不同基因的表達模式又

3、存在差異。大致可總結為兩種情況:一種是誘導4h后上調表達，即瞬時基礎防御;另一種情況是在誘導12h后上調表達，即滯后特異性防御。
　　2、本文通過同源基因克隆法，對GbDRP66319和GbHIR42734的編碼區(qū)進行克隆，測序結果顯示GbDRP66319基因的CDS編碼區(qū)為879 bp，編碼292個氨基酸。通過TMHMM軟件分析跨膜結構域，該蛋白沒有跨膜結構域。GbDRP66319與棉花A和D基因組數(shù)據(jù)庫比對，獲得29個同源基因

4、，根據(jù)SMART等軟件分析保守結構域，結果顯示其含有P-loop，Kinase2，Kinase3，GLPL and MHDL五個motifs，以及LRR BAC，LRR CC和LRR TYP等抗病基因的保守結構域。GbHIR42734 CDS編碼區(qū)為855 bp，編碼284個氨基酸。通過TMHMM軟件分析跨膜結構域，該蛋白沒有跨膜結構域。GbHIR42734與棉花A和D基因組數(shù)據(jù)庫比對，獲得6個同源基因，該類蛋白均含有植物過敏反應誘導的

5、家族蛋白的保守結構域SPFH(Stomatins、Prohibitin、Flo-tillins、Hflk/C)結構域和PHB(Prohibitin homologues)。
　　3、對GbDRP66319和GbHIR42734進行組織特異性表達分析發(fā)現(xiàn)，GbDRP66319在黃萎病菌誘導12h后抗病品種的下胚軸和子葉中的表達量顯著高于感病品種，并在抗病品種各組織中下胚軸表達量顯著最高。GbHIR42734在黃萎病菌誘導12h后的抗