組胺及其H2受體在心肌肥厚中作用及機制的研究.pdf

1、研究意義:
　　壓力后負荷導致的心肌肥厚是心力衰竭病理過程中至關重要的環(huán)節(jié)。許多的機制試著來闡明這種壓力負荷導致心肌結構的改變,其中一種就是體液因子如血管緊張素II、腎上素等的釋放促進心肌肥厚的發(fā)生。而這些體液因子發(fā)揮促肥厚作用主要是通過Gq和Gs蛋白偶聯(lián)受體介導的。組胺及其受體在心血管中廣泛分布,但是有關心臟局部組胺的來源,以及組胺與其它傳統(tǒng)導致心肌肥厚的因素的關系一直未見報道。
　　本課題采用主動脈縮窄術(TAC術)致心

2、肌肥厚模型,引進組氨酸脫羧酶基因敲除的小鼠,從整體動物到單個細胞水平,證實組胺是否參與心肌肥厚的病理過程,并探討介導組胺作用的受體以及機制。為進一步的深入研究心肌肥厚的致病機制,為臨床治療心肌肥厚提供新的藥物靶點。
　　目的:
　　1)明確組胺及其組胺H2受體參與心肌肥厚的作用。
　　2)探討激動組胺H2受體促心肌肥厚的作用的分子學機制。
　　方法:
　　1)主動脈弓縮窄術與腹腔注射藥物的方法建立心肌肥厚的

3、動物模型。
　　2)原代心肌細胞培養(yǎng)的方法建立體外細胞實驗模型。
　　3)藥理學的方法給予組胺H2受體的拮抗劑法莫替丁與阻滯dimaprit。
　　4)ELISA的方法檢測心肌組織與血漿中組胺的含量。
　　5)細胞免疫熒光的方法檢測心肌細胞中特異性蛋白a-actinin。
　　6)westernblot的方法檢測目標蛋白的表達變化。
　　7)應用膜片鉗技術檢測ⅠCa-L開放的情況。
　　8)Re

4、al-TimePCR檢測心肌肥厚相關標志物的mRNA的表達情況。
　　9)HE染色檢測心肌組織形態(tài)學改變。
　　10)采用小動物超觀察小鼠心臟功能指標。
　　結果:
　　1)觀察其致心肌肥厚模型建立是否成功。TAC術后4周進行小動物M型超聲觀察,與sham組相比,TAC術組的小鼠左心室射血分數(shù)(EF％)和短軸縮短率(Fs%)均明顯的降低(P<0.01),心體比、心肌細胞橫截面積以及ANP、BNP均顯著升高(P<0

5、.01),說明心肌肥厚模型建立成功。TAC術后2W、4W用小鼠組胺 ELISA試劑盒檢測心肌組織與血漿中組胺的含量,發(fā)現(xiàn)組胺含量增加且存在一定的時間-效應關系,在4W時,與sham組相比,血漿與心肌組織中組胺的含量分別增加了46.7%、54.2%,這些數(shù)據(jù)提示了組胺可能參與了壓力后負荷誘導的心肌肥厚的病理生理過程,為了證實這一點,我們引進組氨酸脫羧酶基因敲出的小鼠,在TAC術后4W,與野生型小鼠相比,發(fā)現(xiàn)心肌肥厚指標:心體比、心肌細胞橫

6、截面積和ANP、BNP的表達量均顯著降低(P<0.01),而心功能指標射血分數(shù)與短軸縮短率顯著上調(P<0.01)。這些結果證實組胺參與壓力后負荷導致的心肌肥厚的病理生理過程。
　　2) western-blot檢測TAC術4W后組胺H1、H2受體的表達量的變化,與sham組相比,組胺H2受體的表達量明顯上調(P<0.01),而組胺H1受體的表達量變化沒有統(tǒng)計學意義。而上述結果提示組胺可能是通過激活心肌組織上的組胺H2受體來參與心

7、肌肥厚的病理過程。為了證實上面的結論,我們采用藥理學研究方法,觀察組胺H2受體的激動劑與拮抗劑與對心肌肥厚病理生理的影響。通過應用組胺H2受體特異性激動劑dimaprit作用于整體動物的心肌組織與離體心肌細胞,直接觀察組胺H2受體是否參與心肌肥厚的病理過程。本實驗發(fā)現(xiàn):給予C57小鼠dimaprit干預,導致小鼠心體比、心肌細胞橫截面積與心肌肥厚相關標志性基因表達量明顯增高(P<0.01),同時通過小鼠M型超聲檢測發(fā)現(xiàn)心功能指標左室射血

8、分數(shù)與左室短軸縮短率均明顯降低(P<0.01);給予C57小鼠乳鼠提取的原代心肌細胞dimaprit進行干預,導致心肌細胞橫截面積、心肌肥厚相關標志性基因表達量顯著增加(P<0.01)。且這與dimaprit之間存在一定的劑量-效應關系,進一步提示了激動組胺 H2受體參與心肌肥厚的病理過程。另一方面,建立 TAC心肌肥厚模型,給予組胺 H2受體拮抗劑 famotidine,檢測發(fā)現(xiàn) famotidine可以導致TAC術后4W小鼠心體比、

9、心肌細胞橫截面積、ANP的mRNA的表達量均顯著降低(P<0.01),并且改善心功能指標左心室射血分數(shù)與左心室端州縮短率等(P<0.01),這些證據(jù)在提示famotidine有延緩TAC術導致心肌肥厚的病理進程效應,并且famotidine劑量與心肌肥厚的程度呈負相關,進一步提示組胺H2受體拮抗劑可以延緩心肌肥厚的病理生理過程。以上兩個實驗證實了組胺可能參與心肌肥厚的病理生理過程。
　　3)將原代心肌細胞分成 control組、i

10、soprenaline組、histamine組、dimaprit組、famotidine組以及dimaprit與famotidine共同用藥組,給予各種處理48h,dimaprit與histamine可以顯著提高磷酸化的PKA與CaMKⅡ的表達量(P<0.01),且給予famotidine又可以阻滯dimaprit導致的磷酸化的PKA與CaMKⅡ的上調(P<0.01)。而對于Epac1、Epac2沒有任何統(tǒng)計學上的改變。這些結果提示激動

11、組胺H2受體后,通過第二信使PKA的活化,鈣離子的積累最終介導CaMKⅡ誘發(fā)心肌肥厚的發(fā)生。細胞內Ca2+濃度升高是誘發(fā)心肌肥厚、心肌缺血再灌注損傷等心血管疾病的病理生理的中心環(huán)節(jié)。肌質網(wǎng)ryanodine內鈣釋放是導致心肌細胞內鈣濃度升高的主要來源,而L型鈣通道開放是調控肌質網(wǎng)ryanodine受體的主要因素,L型鈣通道的密度越大,其誘發(fā)的心肌肥厚的程度會越大。我們研究發(fā)現(xiàn),組胺H2受體激動劑dimaprit可以促進L型鈣通道的開放,

12、使L型鈣通道的數(shù)目增加,進而引發(fā)細胞內的鈣超載,而famotidine可以抑制dimaprit誘發(fā)的L型鈣通道的開放,緩解心肌細胞內鈣超載引發(fā)的心肌肥厚。這說明激動組胺H2受體可以誘導 L型鈣通道的開放。綜上所示,組胺H2受體激活后,可能是通過PKA-Ca2+-CaMKⅡ信號通路軸來介導心肌肥厚的發(fā)生。
　　結論:
　　1)組胺及其H2受體參與了心肌肥厚的病理過程。
　　2)組胺H2受體激動后,通過經(jīng)典的Gs-pka-