橡膠林土壤宏基因組文庫的構建及拮抗稻瘟菌克隆子的篩選.pdf

1、稻瘟病是水稻生產上具有毀滅性的病害之一，從可培養(yǎng)的微生物中篩選拮抗菌對稻瘟菌進行生物防治，這一思路被證明是行之有效的。然而自然界中有99％的微生物不能被培養(yǎng)，這就大大的降低了篩選效率。本試驗避開了傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，利用宏基因組克隆技術構建土壤宏基因組文庫，并從中篩選對稻瘟菌具有拮抗作用的克隆子，不僅有著重要的理論意義和實際意義，并為稻瘟病的生物防治奠定了基礎。 本文首次構建了橡膠林土壤宏基因組文庫。即提取橡膠林土壤微生物

2、基因組DNA，用pstⅠ酶切后，酶切液與pBluescriptKS+載體連接并導入大腸桿菌DH5a，構建了包含7680個克隆子的宏基因組文庫。酶切鑒定結果發(fā)現，76.2％的質粒含有外源DNA，插入片段的平均大小約為4.3kb，DNA文庫的容量約為32.25MB。 隨機挑取20個克隆子進行測序，NCBI的Blastx分析結果發(fā)現，插入的片段與細菌、真菌、放線菌、真核原生生物等有同源性，說明構建的橡膠林土壤宏基因組文庫多樣性比較豐富

3、。3號與不能培養(yǎng)的微生物(CandidatusKuenenia)有一定的同源性.5號與(Rickettsiellagrylli)同源性達83％，可以初步推斷其功能為吡哆醛生物合成裂解酶PdxS。11號和16號與分類地位尚未確定的細菌(Solibacter)有同源性，隨機測序的這20個序列中，部分序列除了與裂解酶、蛋白酶、激酶等蛋白有一定的同源性外，有5個與功能尚不清楚的蛋白有一定的同源性，其中13號與歐文氏菌屬的同源性達到100％。

4、 通過序列篩選和功能篩選相結合的方法，對宏基因組文庫進行篩選。序列篩選是通過設計的引物進行PCR擴增，擴增獲得的11個克隆子做為初篩結果。然后利用外源基因在宿主細胞是否表達功能進行復篩，首次成功的篩選到兩個對稻瘟菌有拮抗作用的克隆子，具體如下： 將克隆子搖菌培養(yǎng)5天，菌液離心，離心所得的上清液按一定的比例加到培養(yǎng)基.中，倒入平板進行抑菌試驗。結果發(fā)現，克隆子JKDL-1和JKDL-2對稻瘟菌有明顯的抑制作用，克隆子JKDL-