雷公藤紅素抑制反式維甲酸引起的分化綜合征及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究.pdf

1、急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukeamia, APL)是急性髓性白血病的特殊亞型。早期APL的治療方案以葸環(huán)類藥物聯(lián)合阿糖胞苷為主,但其完全緩解率很低,且在治療過程中,常因并發(fā)性彌散性血管內(nèi)凝血或原發(fā)性纖維蛋白溶解引起嚴(yán)重出血,最終導(dǎo)致患者早期死亡。
　　 反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是APL治療效果顯著提高的里程碑式藥物。ATRA能誘導(dǎo)APL細(xì)胞分

2、化和凋亡,使APL患者得到有效治療,患者4-5年無疾病生存率達(dá)70-80％。目前,ATRA已成為治療APL的首選藥。但在ATRA治療APL過程中,約四分之一的患者會發(fā)生分化綜合征(differentiation syndrome,DS),這是一種能導(dǎo)致死亡的嚴(yán)重副作用,主要表現(xiàn)為呼吸窘迫,不明原因發(fā)熱,體重減輕,間質(zhì)性肺浸潤,胸腔或心包積液,高血壓和急性腎衰竭,其中肺浸潤最為常見。及早明確診斷DS和應(yīng)用地塞米松等激素進(jìn)行治療,可降低DS

3、的相關(guān)死亡率,但DS的早期明確診斷相當(dāng)困難,而且由于激素的毒性大而不能常規(guī)使用以預(yù)防DS的發(fā)生。因此,揭示DS的發(fā)生機(jī)制,尋找有效預(yù)防或治療該綜合征的方法,成為目前亟待解決的一個重要課題,受到研究者的高度關(guān)注。
　　 DS臨床病理特征是微血管損傷,主要表現(xiàn)為水腫、出血、纖維蛋白滲出、白細(xì)胞浸潤等,顯示DS的類似炎癥的病理表現(xiàn)。應(yīng)用地塞米松進(jìn)行治療有效,亦佐證該綜合征具有炎癥性特征。但導(dǎo)致這種病理改變的機(jī)制尚未完全明確,目前的研究

4、普遍認(rèn)為,該綜合征的發(fā)生,至少涉及三個環(huán)節(jié):首先是血管內(nèi)細(xì)胞聚集增加。APL細(xì)胞被ATRA誘導(dǎo)分化成熟過程中,其表面與細(xì)胞粘附、聚集相關(guān)的重要粘附分子,如細(xì)胞間粘附分子(intercellular adhesion molecular1,ICAM-1)表達(dá)升高,APL細(xì)胞間(自血病細(xì)胞/白血病細(xì)胞)相互粘附能力增加,導(dǎo)致細(xì)胞聚集,引起小血管血流變慢,甚至阻塞。其次是細(xì)胞出血管能力增加。APL細(xì)胞被ATRA誘導(dǎo)分化成熟后,表面粘附分子表達(dá)

5、增加,與血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附能力增加,助長其出血管;體內(nèi)外阻斷ICAM-1的表達(dá),能減輕ATRA導(dǎo)致的白血病細(xì)胞粘附力與肺浸潤。最后是進(jìn)入組織后的細(xì)胞炎癥反應(yīng)能力增加。被ATRA誘導(dǎo)分化成熟后的APL細(xì)胞,能分泌引起炎癥反應(yīng)的因子和酶,大量進(jìn)入組織后,啟動類似炎癥的反應(yīng),能造成組織損傷。因此,阻斷上述環(huán)節(jié),如阻斷粘附分子的表達(dá)、抑制細(xì)胞釋放炎癥因子,被認(rèn)為能用于治療DS。
　　 雷公藤系衛(wèi)矛科植物,長期以來作為治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自

6、身免疫性疾病的藥物。雷公藤紅素是從雷公藤中提取的一種三萜類單體,有很強(qiáng)的抗炎癥作用。多種動物疾病模型證實(shí),雷公藤紅素對膠原性關(guān)節(jié)炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、阿爾茨海默病等有顯著的治療作用。細(xì)胞和分子生物學(xué)研究顯示,雷公藤紅素能抑制炎癥因子如TNF-α和IL-1β等的合成與釋放;阻斷炎癥因子與其靶結(jié)合引起的效應(yīng),如炎癥因子能引起內(nèi)皮細(xì)胞活化、表達(dá)ICAM-1, VCAM-1和E-selectin等粘附分子,而雷公藤紅素對此有強(qiáng)烈抑制作用。<

7、br>　　 本課題組在前期研究中用炎癥因子刺激原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC建立炎癥反應(yīng)模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能阻斷炎癥因子導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E-seleetin,并阻斷活化內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的粘附,其阻斷作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于地塞米松、布洛芬等常用抗炎癥藥物。鑒于ATRA誘導(dǎo)引起的白血病細(xì)胞表面多種粘附分子的表達(dá)及多種炎癥因子的分泌,是DS肺浸潤的分子基礎(chǔ),我們用急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4為細(xì)

8、胞模型進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素能抑制ATRA導(dǎo)致的白血病細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附增加。
　　 基于上述結(jié)果,我們提出了雷公藤紅素治療DS的設(shè)想。本課題在證實(shí)雷公藤紅素不影響ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化效果,但能抑制ATRA治療產(chǎn)生的致命副作用-分化綜合征的基礎(chǔ)上,深入分析了其作用的機(jī)制。
　　 一、雷公藤紅素抑制反式維甲酸引起的分化綜合征
　　 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素能抑制ATRA導(dǎo)致的白血病細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附增

9、加,提示雷公藤紅素可能用于治療分化綜合征(DS)。但雷公藤紅素是否會干擾ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化這一治療效果？本部分研究首先用細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生化指標(biāo)、分子標(biāo)志等指標(biāo),觀察雷公藤紅素對NB4細(xì)胞分化成熟的影響。結(jié)果表明在細(xì)胞形態(tài)上,雷公藤紅素不影響ATRA導(dǎo)致的NB4細(xì)胞的胞漿量增多,細(xì)胞核出現(xiàn)核偏位,有些胞核由凹陷變?yōu)槟I形,甚至出現(xiàn)桿狀或分葉核等粒細(xì)胞系分化的形態(tài)學(xué)特征。在硝基藍(lán)四氮唑藍(lán)(NBT)還原功能上,雷公藤紅素能協(xié)同ATRA誘導(dǎo)

10、的NB4細(xì)胞的NBT還原反應(yīng)能力。在調(diào)節(jié)分化抗原表達(dá)上,除了CD33外,雷公藤紅素對ATRA導(dǎo)致的NB4細(xì)胞膜表面分化抗原CD11b、CD13和CD15變化沒有影響。結(jié)果表明雷公藤紅素對ATRA導(dǎo)致APL細(xì)胞分化成熟的能力沒有影響。
　　 雷公藤紅素能抑制ATRA導(dǎo)致的白血病細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,同時(shí)又不會影響ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化成熟。因此,雷公藤紅素能否作為治療DS的新藥物,值得進(jìn)一步研究。我們按文獻(xiàn)構(gòu)建DS小鼠模型,將

11、體外誘導(dǎo)分化的NB4細(xì)胞尾靜脈注射入重癥免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,再口服ATRA或者腹腔注射雷公藤紅素,組織化學(xué)檢測雷公藤紅素抑制ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞浸潤肺部的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA能引起細(xì)胞肺浸潤,這種細(xì)胞浸潤可被雷公藤紅素抑制。
　　 以上結(jié)果表明,雷公藤紅素不影響ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化成熟作用但在體內(nèi)能抑制ATRA誘導(dǎo)的肺浸潤。
　　 二、雷公藤紅素通過抑制反式維甲酸誘導(dǎo)ICAM-1表達(dá)而減輕分化綜

12、合征
　　 多種因素參與ATRA導(dǎo)致的細(xì)胞組織浸潤過程,但ATRA導(dǎo)致的細(xì)胞粘附增加,是引起分化綜合征早期細(xì)胞出血管浸潤組織的關(guān)鍵。ATRA誘導(dǎo)APL細(xì)胞分化過程中,分化的APL細(xì)胞表面表達(dá)大量與細(xì)胞粘附相關(guān)的分子,使得APL細(xì)胞易穿越血管而浸潤肺,結(jié)果導(dǎo)致超炎反應(yīng)的發(fā)生。因此,我們猜想雷公藤紅素對DS的抑制作用,可能與其對細(xì)胞粘附分子的表達(dá)抑制有關(guān)。為了驗(yàn)證該猜想,我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),觀察了雷公藤紅素對ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞表

13、達(dá)粘附相關(guān)分子的影響。
　　 我們首先利用DS動物模型,并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),研究雷公藤紅素對DS外周血中白血病細(xì)胞粘附分子表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),DS小鼠外周血中的NB4細(xì)胞,其表面的粘附分子ICAM-1的表達(dá)增加,而用雷公藤紅素處理之后,這些粘附分子的表達(dá)受到抑制。這些結(jié)果提示,雷公藤紅素抑制ATRA誘導(dǎo)的肺浸潤,可能與其抑制ATRA導(dǎo)致的細(xì)胞粘附有關(guān)。為了進(jìn)一步揭示雷公藤紅素抑制ATRA誘導(dǎo)的肺浸潤的機(jī)制,我們用NB4細(xì)胞為細(xì)胞

14、模型進(jìn)行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA誘導(dǎo)之后,NB4細(xì)胞表面CD11a、CD11b、CD11c、CD49d等粘附分子的表達(dá)也同時(shí)發(fā)生上調(diào),但雷公藤紅素處理后,這些粘附分子的增加沒有受到抑制;對白細(xì)胞穿越血管發(fā)揮重要作用的VCAM-1和E-selectin不被ATRA誘導(dǎo)表達(dá),雷公藤紅素對其的表達(dá)也沒有影響;但是,在DS早期中起重要作用的ICAM-1,其表達(dá)可被ATRA顯著誘導(dǎo),而這種誘導(dǎo)可被雷公藤紅素顯著抑制。
　　 ATRA導(dǎo)致

15、的白血病細(xì)胞分泌的炎性因子和趨化因子,也是DS發(fā)生的重要分子基礎(chǔ),雷公藤紅素對這些因子是否也有影響呢？因此,我們進(jìn)一步檢測了雷公藤紅素對ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分泌炎性因子和趨化因子的影響。結(jié)果顯示,ATRA誘導(dǎo)后,NB4細(xì)胞中炎性因子IL-1β和TNF-α、趨化因子MCP-1和IL-8的分泌明顯增加,雷公藤紅素處理后,MCP-1和IL-8的分泌并未受到影響,而IL-1β和TNF-α的分泌則明顯受到抑制。
　　 以上結(jié)果表明,在體

16、內(nèi),雷公藤紅素能抑制DS外周血中白血病細(xì)胞粘附分子的表達(dá);在體外,雷公藤紅素能明顯抑制ATRA誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、抑制ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分泌IL-β和TNF-α,但不能抑制ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分泌MCP-1和IL-8。這些研究結(jié)果提示,雷公藤紅素對ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞肺浸潤的抑制作用與其抑制ATRA誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)增加有關(guān)。
　　 三、雷公藤紅素通過MEK-ERK抑制反式維甲酸誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá)

17、>　　 多項(xiàng)研究表明,ICAM-1的表達(dá)增加是DS發(fā)生的重要分子因素之一。我們前面的結(jié)果表明,雷公藤紅素抑制ATRA誘導(dǎo)的肺浸潤,與其抑制ATRA誘導(dǎo)白血病細(xì)胞表達(dá)ICAM-1有關(guān)。但是,雷公藤紅素是通過什么途徑抑制ATRA誘導(dǎo)的ICAM-1呢？本研究部分采用小分子抑制劑結(jié)合Western方法,對目前已知的能調(diào)控ICAM-1誘導(dǎo)性表達(dá)的相關(guān)信號通路進(jìn)行篩選,以明確雷公藤紅素抑制ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞表達(dá)ICAM-1的機(jī)制。
　　

18、 我們和其他研究組均發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素是一種新型HSP90抑制劑。而HSP90能通過其結(jié)合的IKK,影響NF-kB的活性,從而調(diào)控ICAM-1的表達(dá)。因此,我們首先觀察在NB4細(xì)胞中,雷公藤紅素抑制ICAM-1的表達(dá),是否與HSP90有關(guān)。我們用HSP90抑制劑17-AAG處理NB4細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),17-AAG的處理不但沒有抑制作用,反而能協(xié)同ATRA刺激NB4細(xì)胞表達(dá)ICAM-1。NF-κB是調(diào)控ICAM-1誘導(dǎo)性表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,

19、而雷公藤紅素在多種細(xì)胞模型中顯示出對NF-κB強(qiáng)烈的抑制作用。因此,我們接著觀察了ATRA對NF-κB的活化作用及雷公藤紅素對該作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA能活化NB4細(xì)胞的NF-κB(p65),而雷公藤紅素對ATRA活化NF-κB有明顯的抑制作用。但是,用NF-κB抑制劑BAY11-7802和PDTC,并不能抑制ATRA導(dǎo)致的ICAM-1誘導(dǎo)性表達(dá)。此研究表明,雷公藤紅素對ATRA誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)的抑制與NF-κB通路沒有直接

20、關(guān)聯(lián)。ICAM-1的誘導(dǎo)性表達(dá)也受JAK/STAT信號通路中的STAT1調(diào)控,而有文獻(xiàn)報(bào)道ATRA能活化NB4細(xì)胞中的STAT1。因此,我們也對此進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示,ATRA能活化NB4細(xì)胞中的STAT1,且雷公藤紅素對該活化有抑制作用,但是,用STAT1抑制劑AG490,也同樣不能抑制ATRA導(dǎo)致的ICAM-1誘導(dǎo)性表達(dá)。
　　 MAPK信號通路也是調(diào)控ICAM-1誘導(dǎo)性表達(dá)的一個重要通路。文獻(xiàn)報(bào)道,ATRA對NB4細(xì)胞的M

21、APK信號通路的關(guān)鍵蛋白P38和ERK有活化作用。因此,我們首先檢測了ATRA對P38、JNK和ERK的活化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA誘導(dǎo)能引起p-P38和p-ERK的表達(dá)明顯上調(diào),而p-JNK的表達(dá)無明顯變化,而雷公藤紅素處理后,P38的活化不受影響,而ERK的活化受到抑制。那么,雷公藤紅素是否通過抑制ERK的活化,發(fā)揮其對ATRA誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)的抑制作用呢？我們進(jìn)一步用ERK抑制劑PD98059,對NB4細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后,再用

22、ATRA進(jìn)行刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ERK抑制劑PD98059能抑制ATRA導(dǎo)致的ICAM-1表達(dá)增加。以上結(jié)果表明,紅素對ATRA誘導(dǎo)的ICAM-1表達(dá)的抑制作用與其對ERK的磷酸化抑制有關(guān)。那么,雷公藤紅素是如何影響ERK的活化呢？有文獻(xiàn)報(bào)道雷公藤紅素能與ERK直接結(jié)合。在本部分研究中,我們也對雷公藤紅素與ERK的結(jié)合進(jìn)行計(jì)算機(jī)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素的C6與ERK的C164-SH能形成化學(xué)鍵。另外,ERK的活化也受上游蛋白MEK的調(diào)控。因此,

23、為了證實(shí)雷公藤紅素是否是直接通過抑制ERK,影響ATRA誘導(dǎo)的ICAM-1的表達(dá),我們觀察了ATRA對ERK的上游蛋白MEK的作用及雷公藤紅素的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ATRA刺激NB4細(xì)胞15 min,就能誘導(dǎo)MEK發(fā)生磷酸化,60 min MEK的磷酸化水平達(dá)到高峰,而雷公藤紅素處理能明顯抑制ATRA導(dǎo)致的NB4細(xì)胞MEK的磷酸化。同樣,用MEK抑制劑U0126進(jìn)行處理后,ATRA誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞表達(dá)ICAM-1增加也受到了抑制。