MicroRNA 126-5p調控骨巨細胞瘤增殖及破骨微環(huán)境的機制研究.pdf

1、研究背景與目的:骨巨細胞瘤(GCT)是臨床上較為常見的原發(fā)良性骨腫瘤，約占全部骨腫瘤的6％。骨巨細胞瘤常見于20-40歲人群，好發(fā)于四肢長骨的干骺端。盡管被定義為良性腫瘤，骨巨細胞瘤往往表現(xiàn)出極強的侵襲能力，而溶骨性骨破壞是其最為顯著的臨床特征。溶骨性骨破壞可引起嚴重骨痛并可導致病理性骨折，是影響骨巨細胞瘤患者生活質量的主要因素。骨巨細胞瘤對放化療均不敏感，外科手術切除病灶是其最主要的治療方案。外科切除技術的進展，特別是整塊切除方式在臨

2、床上的廣泛應用使得骨巨細胞瘤的治療上了一個臺階，但骨巨細胞瘤的術后復發(fā)率仍居高不下，最高可達41.7％。鑒于其侵襲性生長方式和術后高復發(fā)率，目前傾向于將骨巨細胞瘤定義為交界性或具有惡性潛能的骨腫瘤。溶骨性骨破壞和腫瘤異常增殖是骨巨細胞瘤治療中的難點，也是影響患者生活質量和整體生存時間的關鍵影響因素，但其具體的發(fā)病機制尚不明確。
　　骨巨細胞瘤起源于骨髓內間葉組織，主要由三種細胞所構成，分別是:破骨細胞樣多核巨細胞、梭形基質細胞以及

3、單核細胞。既往研究曾認為多核巨細胞是骨巨細胞瘤的主要效應細胞和腫瘤成分，但近幾年來的研究證實梭形基質細胞(GCTSC)才是骨巨細胞瘤中唯一具有無限增殖能力的腫瘤成分并且在骨巨細胞瘤溶骨性骨破壞過程中起到最關鍵的作用。GCTSC來源于骨髓間充質干細胞(BMSC)，而不同于BMSC的是，GCTSC不但借由自身的異常細胞復制能力維持骨巨細胞瘤的過度增殖特性，還可以分泌大量破骨微環(huán)境相關細胞因子來誘導多核巨細胞的形成導致溶骨性骨破壞。因此，探索

4、GCTSC如何具備異常增殖以及過度分泌破骨相關因子的能力，對揭示骨巨細胞瘤的發(fā)生以及溶骨性骨破壞的分子機制至關重要，對骨巨細胞瘤的預防、治療以及尋找新的藥物靶點具有較高的基礎科學及實際應用價值。
　　基質金屬蛋白酶13（MMP-13）是體內重要的膠原酶，可高效降解軟骨中的蛋白多糖，同時還具有降解細胞表面的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原的能力。MMP-13在血管再生、創(chuàng)傷修復、結締組織病、腫瘤浸潤與轉移等多個生理病理過程中發(fā)揮重要作用，研究證實M

5、MP-13在骨巨細胞瘤中表達量升高并且參與骨巨細胞瘤破骨微環(huán)境以及溶骨灶的形成。
　　甲狀旁腺素相關肽(PTHrP)是由甲狀旁腺細胞分泌的單鏈多肽類激素，與甲狀旁腺素有著同樣的N端結構，通過與甲狀旁腺素Ⅰ型受體結合在體內發(fā)揮作用。既往研究發(fā)現(xiàn)PTHrP在骨巨細胞瘤中表達量升高，并通過調控RANKL(NF-κ B ligand)、MMP-13、IL-8等破骨相關因子的表達促進溶骨灶的形成，同時PTHrP還通過抑制梭形基質細胞的凋亡增

6、強骨巨細胞瘤增殖能力。
　　Runt轉錄因子-2(Runx2)是Runt家族重要成員，在成骨細胞分化及骨骼形成過程中發(fā)揮重要作用。研究表明Runx2在骨巨細胞瘤中表達量明顯升高并通過調控多個因子的表達影響骨巨細胞瘤的發(fā)生以及生物學行為。
　　微小RNA(microRNA)是一類平均長度約為22 nt的非編碼RNA，在體內廣泛存在，主要通過與下游靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域結合并抑制其翻譯過程而發(fā)揮作用。通過對人類基因組序列

7、的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)超過三分之一的人類基因可被microRNA所調控。目前microRNA在腫瘤中的作用是國內外基礎研究的重點和熱點，但其在骨巨細胞瘤中的具體作用機制尚不明確。MicroRNA126-5p（miR-126-5p）定位于表皮生長因子樣蛋白基因內含子區(qū)域，研究證實miR-126-5p在肺癌、乳腺癌、腎癌的發(fā)生及惡性生物學行為中發(fā)揮著重要作用，但它在骨巨細胞瘤中的作用尚未有報道。
　　研究內容與方法:選取2011年07月

8、至2012年06月在第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院接受手術治療的骨巨細胞瘤患者的典型腫瘤標本，另取正常松質骨對照組織進行microRNA基因芯片檢查尋找在骨巨細胞瘤中表達量具有明顯差異的microRNA。利用生物信息學分析查找可能在骨巨細胞瘤中發(fā)揮重要作用的miRNA及其潛在靶基因。
　　利用qRT-PCR、分子原位雜交、熒光免疫觀測技術檢測miR-126-5p在骨巨細胞瘤組織中的表達情況，利用PCR、qRT-PCR、Western b

9、lot、ELISA驗證MMP-13、PTHrP、Runx2在骨巨細胞瘤中的表達情況。選取骨巨細胞瘤典型腫瘤標本進行HE及免疫組化染色進一步明確miR-126-5p、MMP-13、PTHrP、Runx2在骨巨細胞瘤中具體表達情況。通過構建熒光素酶活性報告系統(tǒng)以及潛在結合位點的點突變操作明確miR-126-5p對MMP-13、PTHrP、Runx2的調控關系，并向GCTSC細胞以及骨肉瘤MG63細胞轉染miR-126-5p mimic和mi

10、R-126-5p antagonist進一步明確miR-126-5p對三個靶基因的調控方式。
　　利用Talen技術構建過表達miR-126-5p的骨巨細胞瘤基質細胞穩(wěn)定株OE-miR-126 GCTSC并對其進行驗證。同時利用qRT-PCR、Western blot、ELISA檢測OE-miR-126 GCTSC中miR-126-5p、MMP-13、PTHrP、Runx2的表達情況。將OE-miR-126 GCTSC與骨髓單核細

11、胞條件共培養(yǎng)檢測破骨細胞分化和多核巨細胞的數(shù)目以明確miR-126-5p對破骨細胞分化的影響;利用骨片實驗檢測miR-126-5p對GCTSC介導的溶骨性骨破壞的影響;利用細胞計數(shù)、流式細胞儀、CCK8實驗、細胞周期檢測觀察miR-126-5p對GCTSC增殖能力的影響。
　　為進一步驗證miR-126-5p在體內對于破骨微環(huán)境及GCTSC增殖活性的影響，構建了一系列動物模型進行驗證。首先構建了去卵巢骨質疏松小鼠模型(OVX小鼠模

12、型)檢測miR-126-5p對破骨微環(huán)境的影響;接著利用雞胚尿膜囊模型檢測miR-126-5p對GCTSC增殖能力以及骨巨細胞瘤成瘤的影響;最后我們構建了miR-126-5p特異性敲除鼠全面觀察miR-126-5p對于小鼠生長發(fā)育過程的影響。
　　研究結果與結論:在此項研究中得到了以下結果:
　　1、MicroRNA芯片提示miR-126-5p在骨巨細胞瘤中表達降低，而對腫瘤組織樣本qRT-PCR以及分子原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)mi

13、R-126-5p在骨巨細胞瘤中的表達量較正常松質骨組織中明顯降低，差距具有統(tǒng)計學意義;
　　2、生物信息學分析提示miR-126-5p可能在骨巨細胞瘤中發(fā)揮重要作用，而MMP-13、PTHrP和Runx2是其潛在的靶基因;
　　3、qRT-PCR、Western blot和ELISA檢測提示MMP-13、PTHrP、Runx2、RANKL、IL-8在骨巨細胞瘤標本中表達量升高;HE及免疫組化染色發(fā)現(xiàn)上述因子是由骨巨細胞瘤基質

14、細胞所分泌的;
　　4、熒光素酶活性檢測實驗提示miR-126-5p可直接結合MMP-13、PTHrP和Runx2mRNA3'UTR區(qū)域并抑制其表達，而進一步的轉染實驗則證實miR-126-5p主要影響MMP-13、PTHrP、Runx2的蛋白水平表達;
　　5、利用Talen技術構建過表達miR-126-5p的骨巨細胞瘤基質細胞穩(wěn)定株 OE-miR-126 GCTSC，該細胞株中miR-126-5p的表達量提升了20倍;<

15、br>　　6、破骨細胞分化實驗中，OE-miR-126 GCTSC實驗組破骨細胞分化受到抑制，破骨細胞數(shù)目較對照組明顯減少，破骨活性明顯降低;
　　7、骨片實驗中，OE-miR-126 GCTSC實驗組骨片骨破壞灶較對照組明顯減小;
　　8、增殖實驗中，OE-miR-126 GCTSC實驗組基質細胞數(shù)目明顯減少，細胞增殖活性受到抑制;
　　9、OVX小鼠實驗中，摘除卵巢后小鼠體內miR-126-5p表達量明顯降低，而M

16、MP-13、PTHrP、Runx2的表達量明顯升高，給予外源性miR-126-5p可有效抑制OVX小鼠骨量減少進程，而抑制體內miR-126-5p表達則加重小鼠體內骨質破壞;
　　10、雞胚尿膜囊實驗中，OE-miR-126 GCTSC實驗組骨巨細胞瘤瘤體較對照組明顯減小，而多核巨細胞數(shù)目明顯降低;
　　11、利用TALEN技術成功構建了12只F1代miR-126-5p特異性敲除鼠，需進一步培養(yǎng)繁殖純合子miR-126-5p

17、敲除鼠并全面觀察miR-126-5p對小鼠成長發(fā)育過程的影響。
　　通過上述研究結果，我們證實miR-126-5p作為一個抑癌基因在骨巨細胞瘤的發(fā)生以及生物學行為中發(fā)揮重要作用，它通過直接調控MMP-13、PTHrP、Runx2的表達影響GCTSC的增殖以及破骨微環(huán)境的形成。同時也發(fā)現(xiàn)miR-126-5p還可以間接調控RANKL、IL-8等多個因子的表達，而MMP-13、PTHrP以及Runx2之間也存在較為復雜的調控關系，因此m