mCRT-vGPCR膜表達(dá)融合蛋白應(yīng)用于腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:用基因重組技術(shù)在病毒 G蛋白偶聯(lián)受體(vGPCR)N端融合小鼠鈣網(wǎng)蛋白(mCRT),獲得真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR。將此質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16-F1中,獲得膜上高表達(dá)融合蛋白 mCRT/vGPCR的B16-F1細(xì)胞株,然后體外檢測高表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞被吞噬效應(yīng)。用凋亡藥物處理這種細(xì)胞株后作為免疫原免疫 Balb/C小鼠,研究其激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答的效用。本研究的目的在于探索抗腫瘤免

2、疫預(yù)防和治療的新途徑。
　　方法:(1)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從小鼠黑色素瘤 B16-F1細(xì)胞總 RNA中克隆獲得含mCRT ORF全長序列的DNA片段。(2)從質(zhì)粒 pSG5/vGPCR中克隆獲得 vGPCR ORF全長片段。(3)構(gòu)建融合基因 mCRT/vGPCR并克隆入真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(+)中。(4)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠黑色素瘤 B16-F1細(xì)胞株中,用RT-PCR和Western blotting

3、檢測基因的表達(dá),并用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光鑒定該融合蛋白在細(xì)胞膜上的定位。(5)直接將活的對照 B16-F1細(xì)胞、轉(zhuǎn)染 vGPCR的B16-F1細(xì)胞(B16-vGPCR)和轉(zhuǎn)染 mCRT/vGPCR的B16-F1細(xì)胞(B16-mCRT/vGPCR)接種于Balb/C小鼠皮下,觀察腫瘤生長情況。(6) MTT法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-vGPCR和pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR對 B16-F1細(xì)胞株生長的影響

4、。(7)多胺類似物(BENS)和蒽環(huán)類藥物(米托蒽醌)分別誘導(dǎo)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F1和B16-mCRT/vGPCR細(xì)胞株凋亡,經(jīng)皮下注射免疫 Balb/C小鼠,免疫8天后,用活的B16-F1皮下接種免疫后的Balb/C小鼠,觀察并紀(jì)錄腫瘤生長狀況。(8) ELISA法檢測小鼠血清中細(xì)胞因子的含量。
　　結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-mCRT/vGPCR, pcDNA3.1(+)-vGPCR。

5、(2)獲得膜穩(wěn)定表達(dá)融合蛋白的細(xì)胞株 B16-mCRT/vGPCR。(3)體外吞噬實(shí)驗(yàn)表明,B16-F1細(xì)胞膜上高表達(dá)融合蛋白 mCRT/vGPCR可增強(qiáng)其被吞噬效應(yīng)。(4)膜上高表達(dá) mCRT的B16-F1細(xì)胞在小鼠體內(nèi)生長受抑制,但體外 MTT檢測發(fā)現(xiàn) mCRT的高表達(dá)促進(jìn) B16-F1細(xì)胞的生長。(5)動物實(shí)驗(yàn)表明,包被有融合蛋白mCRT/vGPCR的凋亡B16-F1細(xì)胞作為免疫原可刺激小鼠產(chǎn)生抗同種腫瘤的免疫效應(yīng)。
　　結(jié)