中國主要致病性水霉菌病原及水霉病暴發(fā)預(yù)警研究.pdf

1、水霉?。⊿aprolegniasis）是我國淡水養(yǎng)殖最常見的疾病之一，水霉病會(huì)造成全世界范圍內(nèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。水霉病多發(fā)生在受損傷的魚體表面，并可快速傳播至健康魚中。水霉孢子濃度是水霉病暴發(fā)的關(guān)鍵因素，因此建立快速、特異、準(zhǔn)確的的水霉孢子定量檢測(cè)方法是及時(shí)預(yù)警水霉病暴發(fā)、減少經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵。鑒此，本論文對(duì)主要淡水養(yǎng)殖區(qū)采集的60株疑似水霉病原進(jìn)行分類鑒定。根據(jù)熒光定量 PCR（Real-time PCR）和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LA

2、MP）技術(shù)原理分別設(shè)計(jì)引物，建立兩種水霉孢子的檢測(cè)方法并對(duì)其進(jìn)行了評(píng)價(jià)。利用水霉孢子人工感染草魚試驗(yàn)，通過熒光定量PCR監(jiān)測(cè)明確水霉孢子濃度與草魚水霉病暴發(fā)的關(guān)系。本文主要研究結(jié)果：
　　1、中國主要致病性水霉病原的確定
　　研究應(yīng)用ITS區(qū)分子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析法和限制性片段長度多態(tài)性分析法（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）相結(jié)合，對(duì)近年來分別采集于中國上海、江蘇

3、、江西、四川、河北、浙江、湖北等7個(gè)主要淡水養(yǎng)殖區(qū)的60株疑似致病性水霉菌（Saprolegnia）進(jìn)行鑒定分類，并系統(tǒng)分析了我國已報(bào)道的致病性水霉菌的分類情況，比較了分別分離自魚體和卵的多子水霉的生物學(xué)特性。研究結(jié)果表明，60株疑似水霉菌分為10個(gè)基因型，其ITS-PCR-RFLP譜型一致屬于典型多子水霉(S.ferax)、寄生水霉(S.parasitica)和澳大利亞水霉(S.australis)分組類型；ITS系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

4、顯示，我國致病性水霉菌以多子水霉和寄生水霉為主，二者為我國淡水養(yǎng)殖主要的致病性水霉菌病原。此外，對(duì)魚體和卵來源的多子水霉生物學(xué)特征進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，二者沒有明顯差異，同一致病菌株既可感染魚體也可感染卵。
　　2、熒光定量PCR檢測(cè)方法和LAMP檢測(cè)方法的建立
　　根據(jù)水霉菌保守的ITS（Internal Transcribed Spacer, ITS）序列設(shè)計(jì)特異性熒光定量PCR引物和LAMP方法引物。結(jié)果顯示兩種方法都具有良

5、好的特異性和靈敏度。Real-time PCR與LAMP最低檢測(cè)限相當(dāng)，能夠檢測(cè)到1個(gè)孢子，比傳統(tǒng)PCR檢測(cè)靈敏度高100倍。
　　3、水霉孢子濃度與草魚水霉病誘發(fā)的關(guān)系
　　基于人工感染草魚水霉病模型，利用SYBR Green Real-time PCR檢測(cè)方法監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖水體中水霉孢子濃度與草魚水霉病發(fā)的關(guān)系，明確了養(yǎng)殖水體中水霉孢子濃度達(dá)到104個(gè)/ml時(shí)可引起草魚暴發(fā)水霉病，當(dāng)水霉孢子濃度超過106個(gè)/ml時(shí)，可以引起草