以PPARγ-RXRα為靶點治療多發(fā)性骨髓瘤的實驗研究.pdf

1、一、PPARγ配體羅格列酮與全反式維甲酸對骨髓瘤細胞株生長和調(diào)亡的影響及其機制的研究 目的:觀察過氧化物酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的人工配體羅格列酮(RGZ)與全反式維甲酸(ATRA)在體外對骨髓瘤細胞生長和凋亡的影響并進一步研究其可能的作用機制。 方法:人骨髓瘤細胞U266和RPMI-8226以RGZ、ATRA干預(yù)后，采用3H-TdR摻入法檢測細胞增殖變化；MTT法檢測細胞活力變化；Annexin-V/PI雙染

2、和TUNEL方法檢測細胞凋亡的變化；用半定量RT-PCR方法檢測凋亡抑制蛋白FLIP、XIAP及survivin mRNA表達變化；采用熒光CaspACETM試劑盒檢測caspas-3活性變化。 結(jié)果:RGZ對骨髓瘤細胞的增殖抑制作用與RGZ的劑量直線相關(guān)，與RGZ單用組比較，ATRA與RGZ聯(lián)合對骨髓瘤細胞的增殖抑制作用更明顯；用MTT法檢測細胞活力變化時觀察到，RGZ對骨髓瘤細胞的活力產(chǎn)生了相似的抑制作用，并呈劑量、時間依賴

3、性，ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用時能顯著增強RGZ對骨髓瘤細胞活力抑制作用；TUNEL標記后熒光顯微鏡下觀察到，用5μmol/LRGZ處理后，U266細胞內(nèi)即出現(xiàn)綠色熒光斑點，凋亡指數(shù)為(10．4±2．6)％。隨著RGZ濃度的增加，凋亡指數(shù)也增加，以10μmol/L的RGZ培養(yǎng)48h后能誘導(dǎo)(28．6±7．7)％的U266細胞發(fā)生凋亡，而在ATRA單獨培養(yǎng)組，未觀察到顯著的綠色熒光斑點，培養(yǎng)液中聯(lián)合加入RGZ和ATRA后，凋亡細胞的比例較相

4、應(yīng)的RGZ單獨處理組明顯升高；Annexin-V/PI雙染后流式細胞儀檢測也證實RGZ能誘導(dǎo)U266細胞和RPMI8226細胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用呈時間、劑量依賴性，ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用時，凋亡細胞的比例較相應(yīng)的RGZ單獨處理組顯著升高；RT-PCR方法檢測顯示，RGZ能抑制FLIP、XIAP及survivin mRNA的表達，ATRA能協(xié)同RGZ進一步抑制FLIP、XIAP及survivin的mRNA的表達；經(jīng)RGZ處理骨髓瘤

5、細胞的caspase-3活性顯著增加，RGZ與ATRA聯(lián)合處理后caspase-3活性較RGZ處理組顯著增加。 結(jié)論:RGZ能通過抑制FLIP、XIAP及survivin的表達、促進caspas-3的活化從而誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制骨髓瘤細胞的增殖和生長。ATRA能增強RGZ對骨髓瘤細胞的上述作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。 二、RGZ與ATRA對骨髓瘤細胞分化的影響及其機制的研究 目的:研究過氧化物酶體增殖物活化受體γ(

6、PPARγ)的配體羅格列酮(RGZ)與全反式維甲酸(ATRA)對骨髓瘤細胞分化的影響及其可能機制。 方法:人骨髓瘤細胞U266和RPMI-8226以RGZ、ATRA干預(yù)后，用PI染色分析細胞周期變化；瑞氏．姬母薩染色觀察細胞形態(tài)學(xué)變化；流式細胞儀分析CD49e表達變化；用N Antisera to Human Immunoglobulin/L-Chains試劑盒檢測培養(yǎng)上清中輕鏈的含量，Western blot方法檢測p27Ki

7、p1、p21Waf1表達變化。 結(jié)果:經(jīng)RGZ培養(yǎng)后，骨髓瘤細胞的G0/G1期比例較對照組顯著增加，G2/M和S期細胞的比例則相應(yīng)減少，ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用使細胞周期停滯的作用更加顯著；經(jīng)RGZ處理后，骨髓瘤細胞表面CD49e的表達率增加，形態(tài)學(xué)變化也符合骨髓瘤細胞分化成熟的規(guī)律，RGZ與ATRA的聯(lián)合應(yīng)用能使骨髓瘤細胞分化成熟的形態(tài)學(xué)變化和CD49e的表達增加更加明顯；與對照組相比，U266細胞與RPMI-8226細胞經(jīng)A

8、TRA培養(yǎng)后，蛋白的的分泌量無顯著增加。以RGZ培養(yǎng)后，U266細胞與RPMI-8226細胞的培養(yǎng)上清中輕鏈蛋白的濃度分別達到(548．3±28．1)ng/ml和(378．4±25．6)ng/ml，較對照組均顯著增加，在培養(yǎng)液中同時加入ATRA與RGZ后，培養(yǎng)上清中輕鏈蛋白的含量較RGZ單獨處理組增加更為明顯。 結(jié)論:RGZ可能通過上調(diào)p27Kip1、p21Waf1蛋白的表達介導(dǎo)骨髓瘤細胞的周期停滯并誘導(dǎo)骨髓瘤細胞分化、抑制骨髓

9、瘤細胞增殖。ATRA能增強RGZ對骨髓瘤細胞的上述作用，兩者聯(lián)合具有協(xié)同效應(yīng)。 三、羅格列酮與全反式維甲酸對原代骨髓瘤細胞凋亡和分化的影響 目的:觀察RGZ及ATRA對骨髓瘤患者原代骨髓瘤細胞的影響。 方法:采用Mini MRCS系統(tǒng)(Miltemyi Biotec，德國)陽性分離純化法分離5例初治MM患者骨髓中CD138+細胞。獲得的CD138+細胞經(jīng)RGZ、RGZ+ATRA處理后用MTT法檢測細胞的增殖和活性

10、、瑞氏-姬母薩染色觀察細胞形態(tài)學(xué)變化、用Annexin V-FITC/PI標記檢測細胞凋亡變化、CD49e-FITC單抗標記細胞表面分化抗原CD49e檢測、用N Antisera to Human Immunoglobulin/L-Chains試劑盒檢測各樣本中κ及λ輕鏈的含量。 結(jié)果:原代骨髓瘤細胞經(jīng)10μmol/L RGZ培養(yǎng)48后，細胞的活力為66．3％，較對照組顯著降低。原代骨髓瘤細胞經(jīng)1μmol/L ATRA培養(yǎng)后，細

11、胞的活力為87．5％，較對照組降低，但差異無顯著性。當(dāng)1μmol/L ATRA與10μmol/LRGZ聯(lián)合應(yīng)用時，RGZ能顯著增強RGZ對骨髓瘤細胞活力的抑制作用；原代骨髓瘤細胞以1μmol/L ATRA單獨培養(yǎng)72小時后，骨髓瘤細胞在形態(tài)上仍比較原始，較對照組無明顯改變，經(jīng)10μmol/L RGZ處理的原代骨髓瘤細胞在形態(tài)上出現(xiàn)了分化和凋亡的改變，當(dāng)ATRA與RGZ聯(lián)合應(yīng)用時，類似的形態(tài)學(xué)改變更加明顯；5例患者的原代骨髓瘤細胞經(jīng)1μm

12、ol/L ATRA培養(yǎng)48小時后，細胞凋亡的比例較對照組差異無顯著性，經(jīng)10μmol/L RGZ培養(yǎng)48h后，發(fā)生凋亡的比例較對照組明顯增加，在培養(yǎng)液中聯(lián)合加入ATRA后，凋亡細胞的比例較相應(yīng)的RGZ單獨處理組明顯升高，達58．4±11．2％；ATRA對原代骨髓瘤細胞表面的CD49e表達較對照組無明顯增加，以10μM RGZ培養(yǎng)72小時后，原代骨髓瘤細胞表面CD49e的表達率為(14．3±3．2)％，較對照組均明顯上調(diào)，ATRA與RGZ

13、聯(lián)合使用時，原代骨髓瘤細胞CD49e表達率的增加較RGZ單獨處理組更加顯著，達(24．7±5．7)％；5位初治患者的原代骨髓瘤細胞以1μmol/L ATRA培養(yǎng)后，原代骨髓瘤細胞上清中免疫球蛋白輕鏈含量較對照組無明顯增加，以10μmol/L RGZ培養(yǎng)后，原代骨髓瘤細胞的培養(yǎng)上清中免疫球蛋白輕鏈含量均較對照組均明顯上調(diào)，ATRA與RGZ聯(lián)合使用時，有4位患者(4/5)的原代骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清中的免疫球蛋白輕鏈含量較RGZ單獨處理組更加顯

14、著。 結(jié)論:RGZ能激活原代骨髓瘤細胞的PPAR7受體，通過誘導(dǎo)原代骨髓瘤細胞分化、成熟和凋亡，抑制原代骨髓瘤細胞的生長和增殖，并且在誘導(dǎo)原代骨髓瘤細胞分化和凋亡的過程中，ATRA與RGZ也具有協(xié)同效應(yīng)。 四、羅格列酮與全反式維甲酸對多發(fā)性骨髓瘤血管形成及移植瘤生長的影響 目的:了解RGZ和ATRA對骨髓瘤細胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響及并觀察RGZ、ATRA對多發(fā)性骨髓瘤VEGF表達、移植瘤血管形成的影響。

15、方法:U266、RPMI-8226細胞以RGZ、ATRA干預(yù)后，用半定量RT-PCR方法分析VEGF的表達變化；在4周齡Balb/C裸鼠的一側(cè)肩胛部皮下接種0．1ml密度為1×108/ml的U266細胞，接種一周后分別以RGZ、ATRA腹腔注射干預(yù)，各組連續(xù)給藥21d，第21d脫頸處死裸鼠，剝離皮下腫瘤并稱量；將剝離腫瘤置于10％的中性福爾馬林中固定24h，石蠟包埋、切片，分別作H-E染色和CD34和VEGF免疫組化染色。 結(jié)果

16、:半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，骨髓瘤細胞系U266與RPMI-8226細胞均有VEGFmRNA高表達，U266與RPMI-8226細胞在經(jīng)5μmol/L RGZ處理24小時后，VEGF的mRNA的表達水平均下調(diào)。當(dāng)RGZ濃度的增加至10μmol/L時，VEGF的mRNA的表達水平下調(diào)更加明顯，RGZ與ATRA的聯(lián)合應(yīng)用時，VEGFmRNA的表達水平較相應(yīng)的RGZ處理組更加低下；U266細胞接種后在裸鼠皮下均成瘤，腹腔用藥后，RGZ可

17、明顯抑制骨髓瘤細胞在裸鼠體內(nèi)的生長，RGZ處理組的移植瘤的體積和重量分別為785±262mm3和1748±365mg，均顯著低于對照組，并且ATRA與RGZ聯(lián)合能增強RGZ在裸鼠體內(nèi)對骨髓瘤細胞生長的抑制作用，聯(lián)合處理組的移植瘤的體積和重量分別僅為154±89mm3和626±102mg；HE染色顯示對照組移植瘤組織內(nèi)瘤細胞排列密集，間質(zhì)最為豐富，血管生成最多，具有豐富的吻合，RGZ處理組瘤細胞密度降低、血管生成相對較少，以RGZ與ATR