GSK3β調節(jié)細胞自噬在皮膚鱗癌發(fā)病中的作用及分子機制.pdf

1、皮膚鱗狀細胞癌（Squamouscellcarcinoma,SCC）是皮膚科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增加，可多發(fā)，常在短期內快速生長，易形成潰瘍及轉移，嚴重影響患者的健康。目前，皮膚鱗癌確切的發(fā)病機制尚不清楚，治療方法多為手術切除等對癥處理，與其他惡性腫瘤一樣缺乏根治的方法。因此，尋找新的、有效的治療靶點一直是國內外皮膚科學界密切關注的研究熱點。
　　糖原合成激酶3β（Glycogensynthasekinase3β,GSK3β

2、）是一種普遍存在于細胞內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與眾多信號轉導通路的調節(jié)，在胚胎發(fā)育、細胞分化、細胞凋亡、干細胞維持和腫瘤形成等方面發(fā)揮重要的作用，被公認為是一種決定細胞命運的關鍵激酶。紫外線(Ultravioletradiation,UV)尤其是UVB，為誘發(fā)皮膚鱗癌的主要原因之一。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)GSK3β在抑制角質形成細胞惡性增殖中起著至關重要的作用，但是確切的作用機制仍需進一步討論。細胞自噬是機體一種重要的防御和保護機制。

3、細胞通過自噬來降解和清除變性受損、衰老和失去功能的細胞器、蛋白等，在機體的免疫調節(jié)、炎癥反應、腫瘤形成等相關疾病中具有十分重要的作用。大量研究表明UV可提高細胞自噬水平，GSK3β的抑制劑在其它組織中可通過抑制細胞自噬起到保護細胞的作用。那么在皮膚鱗癌的發(fā)病過程中，GSK3β是否可以通過調節(jié)細胞自噬發(fā)揮作用？其作用機制又是什么？這些都需要進一步研究。本研究擬以皮膚鱗癌、癌前病變日光性角化病及小鼠上皮細胞JB6為主要研究對象，首先利用免疫

4、組織化學技術和Westernblot法檢測GSK3β及其磷酸化水平在皮膚鱗癌和日光性角化病組織中的表達，其次采用建立表達不同GSK3β活性的穩(wěn)定轉染細胞株，觀察UVB誘導下，GSK3β對細胞生長的影響并探討可能的作用分子機制，為進一步明確皮膚鱗癌的發(fā)病機制及治療提供理論依據(jù)。
　　研究目的：
　　以皮膚鱗癌、日光性角化病及正常小鼠上皮細胞JB6為主要研究對象，通過組織、細胞和分子水平實驗：
　?。?）觀察GSK3β與皮

5、膚鱗癌發(fā)生、發(fā)展的關系；
　　（2）觀察GSK3β對UVB作用下細胞生長的影響；
　?。?）探討GSK3β發(fā)揮作用的信號通路，并初步闡明UVB作用下GSK3β調節(jié)細胞自噬的分子機制。
　　研究內容和方法：
　　1.采用免疫組織化學技術及Westernblot檢測法觀察GSK3β在皮膚鱗癌及其癌前病變日光性角化病組織中的表達并進行分析，系統(tǒng)評價GSK3β與皮膚鱗癌發(fā)生發(fā)展的關系；
　　2.穩(wěn)定轉染：脂質體法將

6、3種表達不同GSK3β活性的質粒：pCDNA3/GSK3β-WT、pCDNA3/GSK3β-S9A、pCDNA3/GSK3β-K85R轉染至小鼠上皮細胞JB6細胞株，并篩選、鑒定穩(wěn)定表達不同GSK3β活性的細胞株；
　　3.細胞增殖檢測：MTT法檢測UVB誘導下，GSK3β對細胞生長的影響；
　　4.Westernblot和GFP-LC3瞬時轉染法檢測：UVB誘導下，細胞自噬水平的變化和GSK3β對細胞自噬的影響及其分子機制

7、。
　　研究結果：
　　1.GSK3β蛋白在皮膚鱗癌組織中表達下降，癌前病變更為明顯；p-GSK3βSer9蛋白在病變組織中表達均高于正常組織，且在癌前病變中表達最高；p-GSK3βTyr216蛋白表達無明顯差異；
　　2.在UVB誘導下，激活GSK3β（GSK3β-WT和GSK3β-S9A轉染組）可明顯降低細胞存活和細胞自噬水平；而抑制GSK3β（GSK3β抑制劑氯化鋰處理組和GSK3β-K85R轉染組）則可增加細胞

8、存活和細胞自噬水平；
　　3.抑制細胞自噬可增加UVB誘導的細胞死亡；而促進細胞自噬則減少UVB誘導的細胞死亡；
　　4.GSK3β抑制劑氯化鋰處理小鼠上皮細胞JB6后，pAMPKThr172蛋白表達呈時間依賴性增強，而PKR、AKT、PERK蛋白表達未見明顯改變；
　　5.UVB作用下，細胞自噬相關蛋白LC3、Beclin1及GSK3β抑制位點p-GSK3βSer9蛋白表達呈時間依賴性遞增，而GSK3β活化位點p-G

9、SK3βTyr216蛋白表達呈時間依賴性遞減。
　　結論：.
　　1.GSK3β功能在皮膚鱗癌及其癌前病變中是被抑制的，其功能的抑制與皮膚鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關；
　　2.激活GSK3β可減少UVB誘導的細胞存活，而抑制GSK3β，則增加UVB誘導的細胞存活，提示GSK3β對細胞生長具有負調控作用；
　　3.抑制GSK3β可提高pAMPKThr172蛋白的水平和細胞自噬的表達，提示GSK3β很可能通過抑制LKB