溴化乙錠誘導培養(yǎng)對肺癌細胞生物學行為的影響及其誘導線粒體降解的機制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　線粒體是真核細胞內(nèi)存在的雙層膜細胞器，是細胞內(nèi)代謝和能量產(chǎn)生的中心環(huán)節(jié)，同時還是不同細胞信號通路的通信站。實際上，線粒體的功能遠遠不止于此，他還是氧化磷酸化的副產(chǎn)物-內(nèi)源性活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的主要來源。過量的ROS具有潛在毒性，可能導致線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)、線粒體DNA及脂質(zhì)損害，甚至可能通過活化內(nèi)源性凋亡途徑導致細胞死亡。此外，線粒體還與線粒體功能紊亂、心臟功能障礙、衰老

2、和其他疾病相關。因此，線粒體的數(shù)量和功能都需要受到精確調(diào)控，以發(fā)揮維持細胞能量代謝穩(wěn)態(tài)及其他細胞關鍵進程的作用。到目前為止，已經(jīng)有證據(jù)表明自噬引起的選擇性線粒體降解在調(diào)節(jié)線粒體數(shù)量和功能方面發(fā)揮著重要作用。因此，線粒體與自噬之間的關系在于自噬可以選擇性清除異常增多或者受到損害的線粒體，這一過程又叫做線粒體自噬。
　　最開始研究自噬的時候，一般認為其在細胞內(nèi)是一保護性過程?；A水平的自噬通過再循環(huán)和利用細胞內(nèi)成分在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)

3、揮著重要的作用。發(fā)展到現(xiàn)在，有關自噬的研究已經(jīng)超出最初的定義，廣泛應用于生理及病理學的研究。例如，自噬水平異常升高可能與一系列病理過程相關，如感染、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、衰老及腫瘤等。有關自噬與腫瘤的研究中，Beclin-1是最早發(fā)現(xiàn)的把自噬和腫瘤聯(lián)系起來的基因，并在剛發(fā)現(xiàn)時將其定義為腫瘤抑制基因。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，包括MAP-1-LC3和HsGSA7等在內(nèi)的其他一些自噬相關基因(ATG)也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。與自噬相關基因

4、相對應，自噬相關蛋白是自噬過程中的必需因子。微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是哺乳動物體內(nèi)酵母Atg8的同源物，通過剪切體內(nèi)新合成PorLC3C端氨其酸形成LC3-Ⅰ。進而，具有E2樣酶活性的Atg7再將LC3-ⅠC端的22個氨基酸剪切，形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ直接參與自噬體的合成，并且是自噬現(xiàn)象的標志性蛋白。
　　正常情況下，基礎水平的自噬通過生理性清除受損細胞器和長壽命蛋白維持細胞穩(wěn)態(tài)，而在代謝應激或能量危機如營養(yǎng)、生長因子或

5、氧氣剝奪，抑或線粒體損害時，自噬途徑被持續(xù)激活。我們知道，線粒體在細胞生長、分裂及能量代謝等過程中發(fā)揮著非常重要的作用。顯而易見，線粒體的這些功能也是腫瘤細胞增殖、存活及轉(zhuǎn)移所必需的。根據(jù)文獻報道，在血清饑餓條件下，自發(fā)線粒體膜電位去極化的頻率是增加的，這些受損的線粒體進入酸性液泡，被自噬體和自噬溶酶體內(nèi)捕獲及降解。為研究肺癌細胞的能量代謝，我們通過低劑量溴化乙錠(ethidiumbromide，EtBr)誘導培養(yǎng)的方法敲逐步敲除線粒體

6、DNA，在線粒體DNA逐步缺失的過程中，我們研究發(fā)現(xiàn)線粒體數(shù)量大量減少，線粒體膜電位下降，更重要的是，在誘導培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)自噬標志物明顯增高。因此，我們推測在EtBr誘導的肺癌細胞線粒體DNA敲除過程中，自噬通路被激活，并可能是線粒體降解的機制之一。因此，本文研究在使用低劑量EtBr誘導肺癌細胞線粒體DNA缺失過程中，研究mtDNA缺失程度對肺癌細胞生物學行為的影響，以及進一步探討線粒體降解的可能機制。
　　研究方法:
　　

7、1.肺癌細胞低劑量EtBr誘導培養(yǎng)及線粒體DNA缺失程度的鑒定
　　人肺癌細胞系A549、SPC-A1和H322在含有10％的FBS及雙抗的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞融合度達到90％～95％時進行傳代。為逐步敲除線粒體DNA，細胞培養(yǎng)基中加入250ng/ml的溴化乙錠，連續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)時隔天換液。同時，培養(yǎng)基中額外加入50μg/ml的尿嘧啶和100μg/ml的丙酮酸鈉。分別收集EtBr誘導培養(yǎng)前，及培養(yǎng)后第1、3、5和7天的肺癌細胞，

8、通過實時定量PCR檢測肺癌細胞中線粒體DNA含量及COXⅡ的mRNA表達水平。另外鑒定EtBr誘導培養(yǎng)7天后肺癌細胞對尿嘧啶的營養(yǎng)依賴特性。
　　2.線粒體DNA缺失程度對肺癌細胞生物學行為的影響
　　人肺癌細胞A549、SPC-A1和H322在含EtBr的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1、3、5和7天，將細胞用胰酶消化并計數(shù)，分別進行細胞增殖、克隆形成及細胞遷移實驗，以檢測肺癌細胞mtDNA敲除過程中細胞的增殖及遷移能力。此外，通過PⅠ

9、染色和AnnexinV-FITC染色進行流式檢測，分別測定不同mtDNA缺失程度肺癌細胞的細胞周期和早期凋亡水平的改變。同時，我們在體內(nèi)研究mtDNA缺失不同程度肺癌細胞的生長情況。首先，用NOD/SCID小鼠建立肺癌細胞的皮下異種移植模型，每只小鼠在左側(cè)皮下注射1×106個EtBr處理不同時間的細胞，待腫瘤體積肉眼可見后每周測量兩次腫瘤體積，到限值時處死小鼠，取出腫瘤測量腫瘤直徑及計算體積。
　　3.EtBr誘導肺癌細胞線粒體降

10、解的鑒定
　　首先，用激光共聚焦驗證線粒體的溶酶體降解過程。EtBr誘導培養(yǎng)不同時間的肺癌細胞在檢測前20分鐘同時加入200nM的綠色線粒體熒光探針和200nM的紅色溶酶體熒光探針，孵育結(jié)束后用新鮮配置的PBS溶液洗滌三遍。隨后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，共聚焦圖像以2μm間隔進行采集。然后，使用TMRM熒光探針和JC-1熒光探針孵育細胞，分別通過激光共聚焦顯微鏡和流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化情況。最后，將EtBr誘導培養(yǎng)后的肺

11、癌細胞固定染色，在透射電鏡下進一步研究EtBr引起的線粒體數(shù)量及超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　4.EtBr誘導肺癌細胞線粒體降解的機制研究
　　首先，通過LTR、MTG雙色熒光探針共定位技術分析線粒體的降解途徑，以及電鏡下觀察線粒體降解的超微結(jié)構(gòu)。然后，我們采用GFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染EtBr誘導培養(yǎng)的肺癌細胞，在共聚焦顯微鏡下觀察LC3的表達水平。隨后，我們用WesternBlot檢測EtBr誘導培養(yǎng)細胞里自噬相關蛋白Beclin-

12、1和LC3的表達情況。同時使用自噬抑制劑3-MA處理，觀察EtBr誘導培養(yǎng)引發(fā)的自噬現(xiàn)象能否被抑制。另外，采用免疫熒光技術檢測EtBr處理肺癌細胞中Beclin-1和PINK1的表達水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.低劑量EtBr誘導培養(yǎng)能逐步敲除肺癌細胞mtDNA
　　我們通過低劑量EtBr誘導培養(yǎng)的方法，能有效地逐步敲除肺癌細胞的線粒體DNA。實時定量PCR結(jié)果顯示肺癌細胞線粒體DNA的兩個標志物在EtBr誘導培養(yǎng)后

13、顯著下降;顯微鏡下可見細胞形態(tài)逐漸向長梭形改變。同時EtBr誘導培養(yǎng)后肺癌細胞對營養(yǎng)依賴性的檢測發(fā)現(xiàn)，EtBr誘導培養(yǎng)7天的肺癌細胞在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中表現(xiàn)出增殖速度減慢，貼壁能力減弱，并逐漸漂浮死亡。因此，本文研究中使用的EtBr劑量能有效敲除肺癌細胞的線粒體DNA，需要補充外源性尿嘧啶維持細胞存活。
　　2.EtBr誘導培養(yǎng)顯著抑制肺癌細胞在體外、體內(nèi)的生長
　　體外細胞增殖、克隆形成及遷移實驗表明EtBr誘導培養(yǎng)導致

14、的肺癌細胞生長和遷移抑制與mtDNA缺失程度密切相關，即線粒體DNA缺失能影響肺癌細胞的生物學行為，但是并不會明顯引發(fā)細胞早期凋亡事件。細胞周期檢測表明EtBr誘導培養(yǎng)引發(fā)細胞周期G0-G1期阻滯。肺癌異種移植模型顯示，EtBr預處理的肺癌細胞比對照組生長明顯減慢，且與mtDNA缺失程度相關。另外，解剖后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，EtBr誘導培養(yǎng)后肺癌細胞體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的機率也明顯降低。
　　3.EtBr誘導培養(yǎng)過程中線粒體發(fā)生降解

15、>　　LTR、MTG雙色熒光探針標記的共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，EtBr誘導培養(yǎng)肺癌細胞的LTR與MTG共定位細胞器結(jié)構(gòu)顯著多于對照細胞。我們在經(jīng)典的血清饑餓誘導培養(yǎng)模型中也觀察到相同的結(jié)果。但是與血清饑餓組細胞相比，EtBr誘導培養(yǎng)引發(fā)的LTR和MTG共定位結(jié)構(gòu)增多更顯著。而在電鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)EtBr誘導培養(yǎng)后肺癌細胞中的線粒體數(shù)量逐漸減少，且與mtDNA的缺失程度相關。另外，TMRM共聚焦結(jié)果和JC-1流式細胞檢測均證實mtDNA逐

16、步缺失過程中線粒體的膜電位顯著下降。
　　4.EtBr誘導肺癌細胞線粒體降解通過自噬途徑完成
　　在EtBr誘導培養(yǎng)的肺癌細胞中，觀察到MTG標記的線粒體數(shù)量明顯減少而LTR結(jié)構(gòu)明顯增多，并且更多MTG標記的線粒體移向LTR結(jié)構(gòu)中。此外，EtBr誘導培養(yǎng)肺癌細胞中GFP-LC3蛋白的表達明顯增多，且從細胞質(zhì)中的彌散分布向點狀聚集改變。WesternBlot實驗結(jié)果也表明在線粒體降解過程中，LC3-Ⅱ的表達水平明顯增加，此過程

17、能被自噬抑制劑3-MA抑制。同時，在EtBr誘導的線粒體降解過程中，Beclin-1蛋白的表達水平也有明顯增高，同樣能被3-MA抑制。而免疫熒光檢測也發(fā)現(xiàn)EtBr處理肺癌細胞中Beclin-1和PINK1的表達水平較對照細胞顯著增高。
　　結(jié)論:
　　1.低劑量EtBr誘導培養(yǎng)可以有效敲除肺癌細胞的線粒體DNA，隨著誘導培養(yǎng)時間增加逐步出現(xiàn)對尿嘧啶的依賴性，且誘導培養(yǎng)后細胞形態(tài)發(fā)生改變。EtBr誘導培養(yǎng)后肺癌細胞的增殖、克隆

18、形成及遷移能力均減弱，且與mtDNA的缺失程度相關;在體內(nèi)，經(jīng)EtBr預處理的肺癌細胞的腫瘤形成能力及生長能力均減弱，同時EtBr誘導培養(yǎng)后肺癌細胞的轉(zhuǎn)移潛能下降。
　　2.EtBr誘導肺癌細胞mtDNA逐步缺失過程中伴隨線粒體的降解，表現(xiàn)為線粒體膜電位下降和線粒體數(shù)量減少。在線粒體的降解過程中，自噬信號通路被激活，該過程能被自噬抑制劑3-MA抑制，因此我們認為自噬是溴化乙錠誘導肺癌細胞線粒體降解的機制之一，并可能受PI3K-Be