APOBEC3基因家族的生物學功能及其作用機制的初步研究.pdf

1、腫瘤發(fā)生的過程中涉及多種基因的異常，基因組不穩(wěn)定性是造成腫瘤發(fā)生的關鍵，其中占人體基因組的17％的LINE-1(L1)被認為在此過程中起著重要的作用。L1是自主性逆轉座子，在漫長的進化過程中被認為是早期整合到基因組中的內病毒。L1有兩個開放的閱讀框架(ORF)，編碼蛋白包括ORF-1p和ORF-2p兩個蛋白，其中ORF-2p具有逆轉錄酶活性，而ORF-1p的功能仍不清楚，L1逆轉座子的激活幾乎在所有癌癥中均能檢測到，是導致基因組不穩(wěn)定性

2、的主要因素，其與癌癥發(fā)生密切相關。正因如此，細胞在長期進化過程中形成了對LINE-1嚴格的限制措施，如通過對其啟動子的超甲基化，抑制其激活，但細胞在應激條件仍可導致其激活，針對這種狀況，細胞中的APOBEC3家族(A3s，包括A3B，A3C，A3F，A3G，A3H)被發(fā)現(xiàn)可通過造成DNA突變的方式，實現(xiàn)對其活性的限制。A3s家族基因是一類具有功能的應激應答基因，當細胞受到病毒等應激刺激，可促進其基因的表達，該家族基因的作用機制是造成單鏈

3、DNA中的TCW（W代表A或者T）處的胞嘧啶脫氨，結果使胞嘧啶轉變?yōu)樾叵汆奏?，從而導致DNA序列的突變。研究發(fā)現(xiàn)A3s在限制LINE-1基因活性以及一些逆轉錄病毒活性的同時，也會造成細胞基因組的其它基因的突變，這樣LINE-1與A3s基因家族的之間博弈，很有可能是導致腫瘤基因組出現(xiàn)高頻率突變的原因，為此，我們通過體外實驗探索A3s對細胞生物學特征的影響以及可能的作用機制。
　　目的:研究A3s基因家族對細胞生物學特征的影響以及在腫

4、瘤發(fā)生過程中的作用及其作用機制。
　　方法:(1)從Hela細胞或A549細胞中提取RNA，通過RT-PCR方法制備A3s基因，測序證實后連接到表達載體pcDNA3.1(+)上。(2)在探究A3s的生物學功能方面，將構建的A3s基因重組表達載體轉染到人胚腎細胞HEK293中，使用WesternBlot鑒定其表達，分別通過細胞劃痕實驗、CCK-8實驗、流式細胞儀檢測分析其對HEK293細胞遷移、增殖、細胞凋亡和周期的影響。(3) A

5、3s在腫瘤發(fā)生過程中的作用及其作用機制的研究方面:本研究探索了A3s家族蛋白與L1ORF1p之間形成蛋白復合體的可能性，由于L1ORF1p為RNA結合蛋白，進一步探索RNA在其中的作用。在探索其對重要癌相關基因的致突變研究中，通過共轉染A3s家族基因以及TP53基因及其啟動子區(qū)、K-RAS基因后，采用3D-PCR(Differential DNADenaturation PCR)檢驗突變情況。
　　結果:通過對A3s基因家族的實驗

6、，我們發(fā)現(xiàn):
　　A3s基因的生物學功能:(1)CCK-8結果顯示，A3B、A3C、A3F、A3G過表達能明顯促進HEK293細胞的體外增殖能力。與空質粒轉染相比，HEK293細胞的體外增殖能力得到極顯著提高(P＜0.01)，增長率分別為19.5％、19.9％、18.9％、15.7％;(2)AnnexinⅤ-FITC、PI染色和流式細胞儀分析表明，A3B、A3C、A3F、A3G過表達能夠抑制HEK293細胞的凋亡，在轉染72h后，

7、HEK293細胞的凋亡率分別為10.53％、19.02％、12.54％、13.95％，而轉染空質粒組的凋亡率為21.31％;(3)PI染色和流式細胞儀分析表明A3B、A3C、A3F、A3H過表達能使HEK293細胞G0/G1期縮短，而S期延長，促進HEK293細胞周期，此結果與細胞增殖實驗結果一致。
　　A3s基因介導的調控機制:(1)co-IP結果表明，A3C、A3F、A3G與L1ORF-1p存在相互作用關系，當用RNA酶處理后

8、，發(fā)現(xiàn)這種相互作用消失，表明A3C，A3F，A3G與L1ORF-1p的相互作用是RNA介導的;(2)HEK293分別共轉染A3C，A3F，A3G與TP53、TP53的啟動子區(qū)、K-RAS基因質粒探究TP53、K-RAS基因突變的產生的機制，結果顯示A3s過表達可增加TP53結構基因以及啟動子區(qū)序列產生突變，而對K-RAS突變無明顯影響。(3)熒光素酶報告基因實驗顯示:A3F-HA能下調TP-53啟動子活性，而A3G-HA能上調TP-53

9、啟動子活性。
　　結論:上述結果證明，人胚腎HEK293細胞中A3s基因表達水平的升高可增強細胞的體外增殖，抑制細胞的凋亡，并造成周期的改變;機制研究發(fā)現(xiàn)，APOBEC3蛋白可通過RNA依賴的方式與LINE1ORF-1p發(fā)生相互作用，這為進一步研究LINE1逆轉座子和A3s家族在腫瘤中的作用提供了實驗基礎。此外，實驗中發(fā)現(xiàn)APOBEC3可能誘導TP53、TP53啟動子區(qū)發(fā)生基因突變，且能引起TP53啟動子活性改變，而對K-RAS基