茭白黑粉菌cAMP及MAPK途徑關(guān)鍵基因的克隆及表達分析.pdf

1、茭白是我國第二大水生蔬菜,廣泛栽培于長江流域及以南地區(qū),具有重要的經(jīng)濟效益。茭白的孕茭與其內(nèi)生真菌茭白黑粉菌的侵染互作關(guān)系密切,茭白黑粉菌的菌絲形態(tài)是決定茭白商品性和食用價值的關(guān)鍵因素。厚垣孢子充滿莖部的灰茭嚴(yán)重影響茭白的經(jīng)濟價值。蛋白質(zhì)組學(xué)和表達譜分析表明 PKA和MAPK關(guān)鍵酶在酵母型和菌絲型茭白黑粉菌中差異表達PKA,它們積極參與了菌絲形成及玉米黑粉菌等真菌從酵母型向菌絲型轉(zhuǎn)變的過程。
　　本研究以分離自“龍茭2號”正常茭和

2、灰茭的茭白黑粉菌為研究材料,利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等研究了茭白黑粉菌cAMP途徑關(guān)鍵基因(UePka)及MAPK途徑關(guān)鍵基因(UeErk、UeMkk、UeSsk)的基因結(jié)構(gòu)、不同碳源下的表達差異及基因之間的互作。結(jié)果如下:
　　一、茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk基因的克隆及序列分析
　　根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果設(shè)計了茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk基因的引物,反轉(zhuǎn)錄PCR獲得各

3、基因的cDNA部分序列,RACE技術(shù)獲得cDNA全長序列。序列同源性分析表明,UePka與玉米黑粉菌的同源性達到93.63％, UeErk與玉米絲黑穗病菌的同源性達到82.21%,UeMkk與大麥堅黑穗病菌的同源性達到83.53%,UeSsk與大麥堅黑穗病菌的同源性達到78.36%。
　　UePka cDNA全長為1949 bp,含有一個1230 bp的開放閱讀框,編碼410個氨基酸,預(yù)測的分子量約為45.78 kDa,理論等電點

4、為8.29,包含555 bp的5‘UTR和161 bp的3‘UTR。UeErk cDNA全長為1828 bp,含有一個1659 bp的開放閱讀框,編碼553個氨基酸,預(yù)測的分子量約為62.05 kDa,理論等電點為6.60,包含7 bp的5‘UTR和10 bp的3‘UTR。UeMkk cDNA全長為2204 bp,含有一個2040 bp的開放閱讀框,編碼680個氨基酸,預(yù)測的分子量約為72.68 kDa,理論等電點為8.09,包含54

5、bp的5‘UTR和107bp的3‘UTR。UeSsk cDNA全長為7625 bp,含有一個5871 bp的開放閱讀框,編碼1957個氨基酸,預(yù)測的分子量約為214.54 kDa,理論等電點為5.19,包含1669 bp的5‘非編碼區(qū)(5‘UTR)和82 bp的3‘UTR。各基因3‘UTR均有典型的poly(A)尾巴。各基因的開放閱讀框都具有絲/蘇氨酸雙特異性蛋白激酶催化域、蛋白激酶ATP結(jié)合位點、絲/蘇氨酸蛋白激酶活化位點這三個特征序

6、列。此外,UePka還具有 AGC激酶 C端特征序列,UeErk還具有MAPK保守位點特征序列。
　　根據(jù)四個基因的 cDNA全長序列,分別設(shè)計了引物進行茭白黑粉菌基因組序列擴增,獲得了四個基因的基因組序列。通過與cDNA序列的比較發(fā)現(xiàn),除UePka含有一個113 bp的內(nèi)含子外,UeErk、UeMkk和UeSsk都不具有內(nèi)含子。
　　二、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk不同碳源下的差異表達分析
　　采用

7、實時熒光定量PCR檢測了四個基因在不同碳源下的差異表達。結(jié)果表明在相對于麥芽糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天,在蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第4天時,UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的表達量上調(diào)顯著,分別為13.3、31.3、183.8、28.6倍;但隨著培養(yǎng)時間的延長,四個基因在兩種碳源培養(yǎng)基中的表達量間沒有顯著差異。顯微觀察表明,在以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)第4天時,酵母型黑粉菌由原來的短桿菌開始出現(xiàn)分支并且菌體變長

8、,逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫z形態(tài)。說明不同碳源條件可以誘導(dǎo)茭白黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)變,四種基因表達量都有明顯上調(diào)表明四種基因在不同程度上都與茭白黑粉菌二型態(tài)的轉(zhuǎn)變相關(guān)。
　　三、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk原核表達
　　分別構(gòu)建了茭白黑粉菌UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的原核表達重組質(zhì)粒pPorf-pET-28a、pEorf-pET-28a、pMorf-pET-28a和pSorf-pET-28a并實現(xiàn)了誘導(dǎo)表

9、達。誘導(dǎo)表達條件為:37℃,180 rpm搖床培養(yǎng)1.5~2 h;OD600為0.4~0.6時加IPTG終濃度至0.2 mM,繼續(xù)培養(yǎng)5~7 h。對原核表達產(chǎn)物進行了SDS-PAGE電泳分析,特異性條帶與預(yù)測的大小相符。
　　四、UePka、UeErk、UeMkk和UeSsk的互作分析
　　采用Ni-NTA親和樹脂來純化目的蛋白。SDS-PAGE電泳分析表明,UePka、UeErk、UeMkk、UeSsk都純化得到了較為單一