晚期氧化蛋白質(zhì)產(chǎn)物在慢性腎臟病進(jìn)展中的作用.pdf

1、研究背景 盡管起始病因不同，腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化為各種慢性腎臟疾病(CKD)進(jìn)展過(guò)程中的共同發(fā)病通路，是腎功能損害嚴(yán)重程度及遠(yuǎn)期預(yù)后的重要預(yù)示標(biāo)志。參與腎小球硬化及間質(zhì)纖維化的因素很多，包括細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，血管緊張素Ⅱ，內(nèi)皮素，補(bǔ)體蛋白質(zhì)，蛋白水解酶，氧化應(yīng)激及機(jī)械因素等。近期研究發(fā)現(xiàn)，各種CKD以及糖尿病病人血漿晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPPs)水平隨腎功能不全的進(jìn)展而升高，提示AOPPs可能在CKD的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮一定作

2、用。 AOPPs的生物化學(xué)特征研究表明，發(fā)生氧化損傷的蛋白質(zhì)主要是白蛋白。在體外用血漿白蛋白與次氯酸作用可得到與慢性腎衰竭(CRF)病人血漿中相似的AOPPs。CRF病人血漿AOPPs水平與雙酪氨酸(蛋白質(zhì)氧化的標(biāo)志)及戊糖素(與氧化應(yīng)激有關(guān)的糖化氧化蛋白)密切相關(guān)。因此，AOPPs可能是氧化應(yīng)激過(guò)程中血漿蛋白與含氯氧化劑反應(yīng)的產(chǎn)物，被認(rèn)為是蛋白質(zhì)氧化性損傷的新標(biāo)志。 本研究以大鼠5/6腎切除(5/6Nx)為慢性腎臟病模型

3、，旨在驗(yàn)證我們提出的假說(shuō)：AOPPs加速慢性腎臟病腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化，參與CKD的進(jìn)展。 研究方法 一.無(wú)內(nèi)毒素AOPPs修飾的大鼠血清白蛋白(AOPPs-RSA)的制備和鑒定，血漿AOPPs濃度按上述方法測(cè)定。為去除血脂對(duì)吸光度的影響，樣本用PBS1∶5稀釋后4℃13000rpm離心1小時(shí)，抽取下層液體檢測(cè)。按文獻(xiàn)方法測(cè)定腎皮質(zhì)勻漿AOPPs濃度。 二.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 分兩步行5/6腎切除，第一周切

4、除左腎的2/3，第二周切除右腎。 三.檢測(cè)指標(biāo) 1.腎功能及血壓：使用試劑盒(肌氨酸，N-甲基甘氨酸氧化酶-過(guò)氧化物β1濃度。 結(jié)果 一.AOPPs慢性負(fù)荷對(duì)殘腎代償性增生的影響 二.AOPPs慢性負(fù)荷對(duì)腎組織損傷的影響 5/6腎切除大鼠從術(shù)后第5周開始，腎小球硬化指數(shù)和間質(zhì)纖維化半定量積分增加，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。注射AOPPs-RSA的大鼠(1組)與注射RSA(2組)及PBS(3組)大

5、鼠相比，腎小球硬化指數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)均顯著增加(P＜0.001)。假手術(shù)各組大鼠的組織學(xué)檢查未見(jiàn)明顯腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。 以RSA和PBS處理的假手術(shù)組大鼠，a-SMA的表達(dá)僅局限于血管平滑肌細(xì)胞。5/6腎切除術(shù)后，其表達(dá)顯著增加。5/6腎切除和假手術(shù)大鼠注射AOPPs后a-SMA表達(dá)均顯著增加。 2.病理組織學(xué)觀察：腎組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋，2μm切片，行PAS及Masson染色。在400倍目鏡下，應(yīng)用顯微鏡網(wǎng)格測(cè)

6、位尺計(jì)數(shù)每個(gè)腎小球所占網(wǎng)格數(shù)，然后用公式計(jì)算腎小球體積(GV)。GV=(P×A)3/2×B/K。其中P代表每個(gè)腎小球的網(wǎng)格數(shù)；A代表每小格面積；B為1.38，代表腎小球假定作為球體的相關(guān)因素；K為1.01，代表腎小球體積有10％的變異系數(shù)。 3.免疫組織化學(xué)觀察；用商品化的抗體作免疫組化染色檢測(cè)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、巨噬細(xì)胞(ED-1陽(yáng)性細(xì)胞)浸潤(rùn)數(shù)量、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-S

7、MA)的表達(dá)和Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原的蛋白質(zhì)表達(dá)。 4.RT-PCR：用QiagenRNA提取試劑盒從腎皮質(zhì)中提取總RNA。 5.氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定：采用硫代巴比妥酸反應(yīng)法測(cè)定腎皮質(zhì)勻漿硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)(TBARS)濃度。腎皮質(zhì)勻漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSHPx)活性的測(cè)定采用5，5'-二硫代對(duì)二硝基苯甲酸(DTNB)法測(cè)定。 6.炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELASA)測(cè)定尿MCP-1及TGF-β1濃度

8、。 結(jié)果 一.AOPPs慢性負(fù)荷對(duì)殘腎代償性增生的影響 實(shí)驗(yàn)中所有大鼠均存活。5/6腎切除大鼠(1組～3組)的殘腎重量與體重比值(KW/BW)隨時(shí)間增加。注射AOPPs-RSA的大鼠(1組)KW/BW值較注射RSA(2組)及PBS(3組)大鼠更高(P＜0.001)。5/6Nx大鼠的腎小球體積亦隨時(shí)間而增大。注射AOPPs的1組與作為對(duì)照的2組和3組相比有顯著差異(P＜0.01)。三組假手術(shù)組中(4組～6組)，注射

9、AOPPs-RSA的4組與5組和6組相比，腎重/體重及腎小球體積均隨時(shí)間而增加，第9周和第13周有顯著差異(P＜0.05)。 二.AOPPs慢性負(fù)荷對(duì)腎組織損傷的影響 5/6腎切除大鼠從術(shù)后第5周開始，腎小球硬化指數(shù)和間質(zhì)纖維化半定量積分增加，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重。 與假手術(shù)各組比較，假手術(shù)各組之間，Ⅰ型膠原和Ⅳ型膠原的沉積無(wú)顯著差異。 假手術(shù)組注射RSA(5組)和PBS(6組)的大鼠腎組織幾乎無(wú)巨噬細(xì)胞浸

10、潤(rùn)。假手術(shù)組大鼠(4組)巨噬細(xì)胞數(shù)也較對(duì)照組(5組和6組)增加，但計(jì)數(shù)顯著低于5/6腎切除大鼠(P＜0.05)。 三.AOPPs慢性負(fù)荷對(duì)腎功能的影響 5/6腎切除后大鼠Scr進(jìn)行性增高，Ccr下降，尿蛋白增加;在五周前收縮壓未升高，但之后逐漸升高。假手術(shù)組大鼠未見(jiàn)上述特征。5/6腎切除大鼠長(zhǎng)期注射AOPPs后Ccr降低顯著快于注射RSA和PBS的對(duì)照組(P＜0.001)，尿蛋白排泄率較對(duì)照組明顯增加(P＜0.001)，

11、而收縮壓與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。假手術(shù)大鼠注射AOPPs后也出現(xiàn)蛋白尿，但Scr、Ccr及收縮壓無(wú)明顯變化。 四.AOPPs慢性負(fù)荷對(duì)氧化應(yīng)激參數(shù)的影響 與相應(yīng)處理的假手術(shù)組相比，5/6腎切除注射RSA(2組)和PBS(3組)大鼠的血漿AOPPs水平升高2.0倍，提示腎大部分切除后AOPPs自發(fā)性產(chǎn)生，且濃度隨時(shí)間而增高。5/6腎切除大鼠的腎皮質(zhì)勻漿中AOPPs濃度也升高。反復(fù)注射AOPPs使5/6腎切除和假手術(shù)大鼠血漿

12、及腎組織AOPPs水平均顯著升高。與注射PBS對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)第13周時(shí)，5/6腎切除大鼠血漿AOPPs水平升高3.0倍，假手術(shù)大鼠升高2.0倍。 血漿AOPPs水平與腎小球硬化指數(shù)，腎間質(zhì)纖維化評(píng)分(r=0.817，n=180，P＜0.001)，腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)以及腎間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)呈正相關(guān)。血漿AOPPs與尿蛋白也呈顯著相關(guān)性。 與同樣處理的注射RSA或PBS假手術(shù)大鼠相比，5/6腎切除大鼠腎皮質(zhì)勻漿TBARS

13、水平顯著升高。5/6腎切除和假手術(shù)大鼠注射AOPPs后TBARS濃度均增加，與同樣手術(shù)方式的RSA和PBS注射組相比有顯著差異。注射RSA(2組)及PBS(3組)的5/6腎切除大鼠較相應(yīng)處理的假手術(shù)大鼠(5組，6組)相比，腎皮質(zhì)勻漿GSHPx活性降低約40％。 血漿AOPPs與腎組織TBARS顯著相關(guān)，腎組織AOPPs水平與腎組織TBARS或GSHPx活性也呈顯著相關(guān)性。 五.AOPPs慢性負(fù)荷對(duì)MCP-1及TGF-β1

14、表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，5/6腎切除大鼠尿MCP-1及TGF-β1水平顯著增加，注射AOPPs大鼠(1組)與注射RSA(2組)和PBS(3組)大鼠相比，尿MCP-1和TGF-β1水平升高更為顯著。假手術(shù)大鼠注射AOPPs(4組)也引起尿MCP-1及TGF-β1增高。免疫組化研究顯示，假手術(shù)組大鼠僅在腎小管上皮細(xì)胞有輕微MCP-1或TGF-β1染色。5/6腎切除大鼠腎小球和小管均可見(jiàn)陽(yáng)性染色，注射AOPPs顯著增加5/6腎切除

15、和假手術(shù)大鼠MCP-1和TGF-β1染色。RT-PCR結(jié)果顯示，5/6腎切除術(shù)后，MCP-1及TGF-β1mRNA表達(dá)增加，AOPPs負(fù)荷顯著增加MCP-1及TGF-β1mRNA表達(dá)。 結(jié)論 我們的研究證實(shí)，在5/6腎切除模型中，AOPPs是一類促進(jìn)慢性腎臟病進(jìn)展的重要新介質(zhì)。AOPPs蓄積通過(guò)氧化還原敏感的炎癥通路促進(jìn)腎臟纖維化，使腎功能惡化。盡管用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)詮釋臨床疾病需要謹(jǐn)慎，但我們的研究結(jié)果揭示了慢性腎組織纖維化和