滋養(yǎng)細(xì)胞系（HPT-8）的建立和鑒定以及HBV在滋養(yǎng)細(xì)胞中分布的膠體金探針示蹤研究.pdf

1、乙型病毒性肝炎(乙肝)是世界流行性疾病，嚴(yán)重地危害著人們的生活和健康。在乙型肝炎病毒(HBV)的傳播途徑中，垂直傳播是十分重要的一種途徑，即HBV可通過(guò)胎盤(pán)引起胎兒感染，又稱(chēng)作HBV宮內(nèi)傳播。目前，乙肝表面抗原(HBsAg)攜帶孕婦的胎兒宮內(nèi)感染率為5％～15％。孕期經(jīng)宮內(nèi)傳播途徑造成的胎兒HBV感染，用乙肝疫苗和高效價(jià)免疫球蛋白不能阻斷，宮內(nèi)感染是乙型肝炎免疫失敗的首要原因。自1992年以來(lái)，我室對(duì)HBV宮內(nèi)傳播機(jī)制進(jìn)行了宏觀和微觀兩

2、方面的系統(tǒng)研究，提出血源性途徑和細(xì)胞源性途徑并存的假說(shuō)。許多研究應(yīng)用免疫病理和分子生物學(xué)技術(shù)證實(shí)胎盤(pán)各層細(xì)胞可以感染HBV。胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞作為胎盤(pán)屏障的第一層細(xì)胞，直接與母親血液接觸，以往的組織病理學(xué)研究也已經(jīng)得到滋養(yǎng)層細(xì)胞感染的證據(jù)，但其確切機(jī)理國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此對(duì)HBV在滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)的研究，成為控制乙肝宮內(nèi)傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究采用膠體金標(biāo)記結(jié)合透射電鏡技術(shù)是一種高分辨率免疫定位需鑒定的抗原于不同亞細(xì)胞部位的有價(jià)值的技術(shù)，為

3、細(xì)胞源性途徑假說(shuō)的提供支持。 目的建立傳代穩(wěn)定的、生物學(xué)特征與體內(nèi)細(xì)胞接近的滋養(yǎng)細(xì)胞株(HPT-8)；通過(guò)膠體金探針標(biāo)記技術(shù)提供HBV進(jìn)入HPT-8的依據(jù)，并建立能分泌HBsAg和HBeAg的轉(zhuǎn)染HPT克隆株。 方法: ①取妊娠6～9wk、發(fā)育正常、新鮮流產(chǎn)胎盤(pán)組織，挑取絨毛，用胰酶和膠原酶Ⅰ混合消化法消化人絨毛組織，用胰蛋白酶消化傳代體外培養(yǎng)，通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡對(duì)HPT-8進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，免疫組化、免疫熒光激

4、光共聚焦和放射免疫法對(duì)HPT-8進(jìn)行生物學(xué)特征研究。 ②HBV陽(yáng)性血清(3×108拷貝/毫升)體外感染HPT-8細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分感染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg，提取洗液、細(xì)胞培養(yǎng)上清和感染后傳代的各代細(xì)胞中DNA用于PCR檢測(cè)HBVDNA，細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞中HBsAg、HBcAg。免疫熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA的滴度。 ③通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將HB

5、V全基因轉(zhuǎn)染HPT-8細(xì)胞，G418篩選，通過(guò)ELISA、免疫組化、PCR等對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。 ④采用乙肝表面抗原單克隆抗體標(biāo)記的膠體金探針對(duì)感染的和轉(zhuǎn)染的HPT-8細(xì)胞中的乙肝表面抗原進(jìn)行標(biāo)記示蹤。 結(jié)果: ①在大多數(shù)原代培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生自然凋亡后，少數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)成為永生細(xì)胞(HPT-8)。細(xì)胞呈多邊形，有細(xì)胞融合后形成的合體滋養(yǎng)層細(xì)胞；細(xì)胞表面的微絨毛豐富，有豐富的糖原顆粒、髓樣小體和明顯的脂滴，以及細(xì)胞間緊密

6、的橋粒樣結(jié)構(gòu)連接；HPT-8細(xì)胞表達(dá)角蛋白7、角蛋白18、波形蛋白、分化抗原9、表皮生長(zhǎng)因子受體、滋養(yǎng)細(xì)胞趨化因子和胎盤(pán)堿性磷酸酶。同時(shí)，HPT-8細(xì)胞能分泌絨毛膜促性腺激素、胎盤(pán)催乳素、雌二醇和孕酮。 ②HBV陽(yáng)性血清與滋養(yǎng)細(xì)胞共孵育48h，HBV能成功感染體外培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞。ELISA檢測(cè)感染組細(xì)胞第1、2代培養(yǎng)上清中HBsAg陽(yáng)性，PCR檢測(cè)感染組第1、2代細(xì)胞上清和細(xì)胞HBVDNA，結(jié)果均陽(yáng)性。免疫組化檢測(cè)感染組第2代細(xì)

7、胞中HBsAg陽(yáng)性。免疫熒光定量PCR檢測(cè)感染組細(xì)胞上清在第1、2代、3代48h的HBV滴度分別為8×104、4.6×103、＜103(拷貝/毫升)。 ③成功將質(zhì)粒pcDNA3-3HBV轉(zhuǎn)染到HPT-8，轉(zhuǎn)染后第1、2代培養(yǎng)上清ELISA檢測(cè)顯示HBsAg、HBeAg陽(yáng)性，第1、2、3代培養(yǎng)上清PCR檢測(cè)前S區(qū)基因片段陽(yáng)性，第2代轉(zhuǎn)染細(xì)胞中存在HBVcccDNA。免疫組化檢測(cè)第2代轉(zhuǎn)染細(xì)胞中HBsAg、HBcAg陽(yáng)性。免疫熒光定

8、量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清48h、20天、40天、60天中HBVDNA滴度分別為：1×105、8×104、7.8×103、60d：3×103(拷貝/毫升)。 ④通過(guò)膠體金探針的標(biāo)記，直觀觀察乙肝表面抗原在細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)水平的分布：乙肝表面抗原存在于轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分泌泡、空泡和溶酶體內(nèi)，以及細(xì)胞膜和絨毛上。乙肝表面抗原存在于感染細(xì)胞的溶酶體內(nèi)、細(xì)胞膜和絨毛上。 結(jié)論: ①建立了體外連續(xù)培養(yǎng)120余代的HPT