載脂蛋白A1模擬肽對巨噬細胞泡沫化的抑制作用及機制.pdf

1、目的：
　　心血管疾病對人類健康造成很大危害，重要的病理機制是動脈粥樣硬化，在動脈粥樣硬化的形成中，巨噬細胞扮演重要角色，而氧化低密度脂蛋白則是泡沫細胞形成的一個主要因素。CD36、SR-A1等清道夫受體與泡沫細胞的形成關系密切，巨噬細胞在CD36、SR-A1的介導下能夠對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）無上限的攝取，大量脂質積蓄在細胞內，從而形成泡沫細胞，進而誘發(fā)動脈粥樣硬化。氧化脂質的細胞毒效應很強，導致泡沫細胞凋亡、壞死，粥

2、樣斑塊構成的脂質核心形成。載脂蛋白 A1是高密度脂蛋白(HDL)的主要蛋白成分，其模擬肽L-4F和D-4F可以促使巨噬細胞中膽固醇外流，抑制血脂紊亂引起的小鼠 AS，而 D-4F是否能夠通過調控清道夫受體表達從而抑制巨噬細胞內脂質蓄積呢？目前尚未見報道。本工作在 ox-LDL誘導的巨噬源性泡沫細胞模型和（內質網應激）ERS誘導劑 TM誘導的ERS模型上，研究SR-A1的表達情況，觀察 ERS抑制劑PBA是否能夠拮抗ox-LDL及 TM對

3、 SR-A1的誘導作用，研究ERS與泡沫細胞形成的關系和作用機制，進一步解釋 ApoA-I模擬肽 D-4F與巨噬細胞SR-A1的相互作用關系。
　　方法：
　　選擇 RAW264.7巨噬細胞進行體外培養(yǎng)，給予ERS抑制劑PBA（20 mmol/L）處理30 min，繼續(xù)用ox-LDL(50 mg/L)干預12 h或2μmol/L毒胡蘿卜素(thapsigagin,TG)或2 mg/LTM培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)另外一組RAW264.

4、7巨噬細胞，給予TM（0.5、1和2 mg/L）處理4 h或2mg/LTM處理1、2和4 h。RAW264.7巨噬細胞用濃度為12.5、25和50 mg/L的D4F、50 mmol/L的紊亂模擬肽sD4F處理1 h或5 mmol/LPBA30 min后，再用100 mg/Lox-LDL培養(yǎng)12 h。另外培養(yǎng)巨噬細胞，給予50 mg/LsD4F或D4F處理1 h后給予2 mg/L TM處理4 h。細胞活力檢測采用MTT法，細胞內總膽固醇含

5、量檢測采用總膽固醇檢測試劑盒；SR-A1和GRP78蛋白表達檢測變化采用免疫印跡法；SR-A1和GRP78mRNA表達檢測采用實時熒光定量PCR技術；Dil-ox-LDL攝取情況檢測采用多功能酶標儀。
　　結果：
　　ox-LDL組和正常對照組比較，巨噬細胞內 TC含量增加顯著(P<0.01)，用 PBA干預后，ox-LDL誘導的巨噬細胞內膽固醇蓄積量降低，與ox-LDL組比較其含量降低32.0％(P<0.05)。ox-LD

6、L處理組和正常對照組比較，ox-LDL組細胞 SR-A1、GRP78蛋白水平上調顯明(P<0.01)，而 PBA對 ox-LDL誘導的SR-A1上調抑制顯著，與 ox-LDL組比較降低48.4%(P<0.05)，細胞內GRP78蛋白表達雖然降低39.3%，但沒有統(tǒng)計學意義(P=0.057)。ox-LDL干預后SR-A1 mRNA水平顯明上調，是對照組1.81倍(P<0.05)；在ox-LDL誘導SR-A1轉錄水平方面PBA干預無明顯影響

7、，與ox-LDL處理組比較，兩組細胞內SR-A1的mRNA表達程度無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。巨噬細胞用TM干預后SR-A1蛋白水平顯明上調，呈時間和濃度依賴性，最高峰為TM處理2 h時(P<0.05)；TM的不同濃度(0.5、1和2 mg/L)雖然能夠使SR-A1 mRNA水平呈上升的趨勢，但統(tǒng)計學無差異(P>0.05)。TM能夠增加巨噬細胞攝取ox-LDL，TM（2 mg/L）尤為顯著(P<0.01)。PBA+ TM處理組與 TM

8、處理組比較，ox-LDL攝取量及 SR-A1、GRP78蛋白水平均降低明顯，分別是TM組的51.3%、53.9%、60.0%(P<0.05)。在TG作用下巨噬細胞SR-A1、GRP78蛋白水平顯著上調，而PBA+ TG組SR-A1、GRP78蛋白水平均降低明顯，分別是 TG處理組的47.5%、58.3%(P<0.05)。巨噬細胞用ox-LDL損傷后，再給予D-4F，巨噬細胞損傷減弱，細胞內膽固醇積蓄量減少。ox-LDL使巨噬細胞SR-A

9、1、GRP78表達水平升高，模擬肽 D-4F明顯抑制上述變化，并呈濃度依賴性。TM處理細胞后，細胞內SR-A1、GRP78表達量升高，但是用D-4F干預后能下降其表達量，同時能夠減少巨噬細胞攝取ox-LDL。
　　結論：
　　ERS在 ox-LDL誘導 SR-A1上調中發(fā)揮重要作用，巨噬細胞吸收ox-LDL生成泡沫細胞。清道夫受體 A1在內質網應激過程中受 ox-LDL刺激表達上調，而Apo-AI模擬肽D-4F能夠對氧化低密