Rli87基因缺失對LM環(huán)境應激及致病力的影響.pdf

1、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種兼性胞內寄生的革蘭氏陽性菌。LM主要通過消化道引起動物和人的感染，是一種重要的人畜共患病原菌，在臨床主要引起人和動物的腦膜炎、敗血癥及流產等，對畜牧業(yè)和人類生命健康造成巨大的威脅，被 WHO列為四大食源性致病菌之一。
　　在 LM感染宿主的過程中需要眾多的毒力因子參與，這些毒力因子的編碼基因主要集中在 LM致病島1（LIPI-1）和致病島2（LIPI-

2、2）2個區(qū)域中，其中LIPI-1含有6個基因，依次為 prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB；LIP-2又稱為內化素小島，主要編碼一些小分子的內化素。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，LM非編碼ncRNA在調控其生長、基因表達、糖代謝、金屬離子轉運、生物膜形成、胞內寄生及環(huán)境應激過程中也扮演了重要的角色，其調控模式已經(jīng)成為 LM調控網(wǎng)絡中的最重要作用方式之一。根據(jù) ncRNAs的調控機制，LM ncRNAs可以分為3種：順式作用 RNA

3、（Cis-acting RNAs，如核糖開關）、反義 RNA（Anti-Sense RNAs，asRNAs）和反式編碼的小 RNA（Trans-encoded small RNAs，sRNAs）。rli87基因屬于 sRNA，然而目前有關 rli87基因的生物學功能尚不清楚。本研究應用同源重組技術構建 rli87基因缺失株 LM-?rli87，研究了 ncRNA rli87缺失對 LM生長特性的影響，探討了 rli87在 LM環(huán)境應激能

4、力和致病性的調控作用。主要研究內容及結果如下：
　　1、單核細胞增生李斯特菌 Rli87基因缺失株的構建、鑒定及其生長特性研究
　　根據(jù) GenBank登錄的 LMEGD-e基因組序列（登錄號：AL591824），用DNAMAN軟件進行同源性分析，選擇保守區(qū)域，用 Primer5.0軟件設計擴增上、下游同源臂引物。利用 PCR技分別擴增 rli87基因上、下游同源臂，然后運用SOE-PCR技術融合上、下游同源臂，獲得 rli

5、87基因缺失片段。將 pMD19-T-△rli87和 pKSV7質粒進行雙酶切，將 rli87基因缺失片段插入到穿梭載體 PKSV7上，構建重組穿梭質粒 pKSV7-△rli87。用電轉化的方法將 pKSV7-△rli87電轉化到LM EGD-e中，對陽性轉化子在氯霉素與42℃條件下傳代培養(yǎng)10代，獲得具有氯霉素抗性的單交換株；然后在無氯霉素42℃條件下傳代培養(yǎng)15代，得到只能擴增出一條584bp的目的片段無氯霉素抗性的雙交換基因重組缺

6、失株LM-△rli87。在無氯霉素壓力37℃條件下傳達培養(yǎng)20代，經(jīng) PCR檢測，結果證實 LM-△rli87缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。在37℃條件下培養(yǎng) LM EGD-e和 LM-△ rli87菌株，兩者生長差異不顯著（p>0.05），該結果證實 rli87基因缺失對37℃生長特性沒有影響。
　　2、Rli87基因缺失對單核細胞增生李斯特菌環(huán)境應激的影響
　　將 LM EGD-e強毒株和構建的 LM-△rli87缺失株于

7、相同條件下培養(yǎng)后，分別測試在不同溫度、pH值、高滲透壓及氧化環(huán)境壓力條件下應急反應，并對應激相關基因的表達量進行檢測。選取低溫30℃和高溫42℃，測定相同培養(yǎng)條件下不同時間點的 OD600nm值，并繪制不同溫度條件下的生長曲線。結果在不用溫度條件下，LM-△rli87生長速度明顯高于 LMEGD-e（p<0.05）。在不同 pH值生長條件下，當 pH=9時兩株菌生長差異顯著（P<0.05）；在2％ H2O2氧化環(huán)境中出現(xiàn)生長停滯，活菌量

8、隨著時間的變化呈下降趨勢，但 LM-△rli87活菌量始終低于 LM EGD-e（P<0.05）；在 pH=9時，與 LM EGD-e菌株相比，LM-△rli87缺失株 rsbV、rsbW、hpt、clpP、ctsR5個應激相關基因的表達量均上升，表明在堿性環(huán)境中 rli87對這5個應激相關基因具有調節(jié)作用。
　　3、Rli87基因缺失對單核細胞增生李斯特菌致病力的影響
　　將 LM EGD-e與構建的 rli87基因缺失株

9、分別感染巨噬細胞 RAW264.7和BALB/C小鼠，測其胞內細菌計數(shù)、細胞粘附率的計算以及存活小鼠的統(tǒng)計，通過 Real-time RT-PCR毒力基因表達量檢測的方法檢測五個毒力相關因子的表達量，并通過溶血試驗分析缺失株與野毒株的致病性差異。結果顯示，與 LM EGD-e相比，LM-△rli87缺失株的粘附率和侵襲力均下降；肝、脾載菌量減少；缺失株的半數(shù)致死量較野毒株升高了103個數(shù)量級；毒力基因 hly和 PrfA的轉錄水平顯著下

10、降。溶血試驗測定結果發(fā)現(xiàn)，與強毒株 LM EGD-e相比，LM-△ rli87的溶血能力明顯降低。由于 LM的溶血能力由 LIPI-I上的 hly基因編碼，結果提示 rli87基因對 hly基因的表達具有調控作用。
　　本研究通過 SOE-PCR技術與同源重組的方法成功構建了 rli87基因缺失株，并研究了 Rli87基因缺失對 LM環(huán)境應激及致病力的影響。與 LM EGD-e相比，Rli87基因缺失株的環(huán)境應激能力下降，致病性減