內(nèi)質網(wǎng)應激參與腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子機制研究.pdf

1、背景與目的
　　顱腦損傷（head injury）是臨床上導致腦死亡（brain death，BD）的主要原因之一。腦死亡是指包括腦干在內(nèi)的全腦功能喪失的不可逆轉的狀態(tài)。腦死亡概念是1959年由法國學者P. Mollaret和M. Goulon在第23屆國際神經(jīng)學會上首次提出并使用，用來描述這種嚴重大腦損傷后失去反射需要機械呼吸支持的不可逆昏迷的狀態(tài)。1966年美國學者提出腦死亡是臨床死亡的標志。在1968年在第22屆世界醫(yī)學大會

2、上，美國哈佛醫(yī)學院腦死亡定義審查特別委員會提出“腦功能不可逆性喪失”作為新的死亡標準，并制定了世界上第一個腦死亡診斷標準，法律上承認腦死亡等同于死亡。目前，世界大多數(shù)發(fā)達國家已認可腦死亡，并相繼頒布腦死亡法，從法律上保障腦死亡臨床診斷。我國2003年中華醫(yī)學雜志等主要醫(yī)學雜志刊登了衛(wèi)生部腦死亡判定標準起草小組制訂的《腦死亡判定標準（成人）（征求意見稿）》和《腦死亡判定技術規(guī)范（成人）（征求意見稿）》。2009年4月，經(jīng)過修改與完善，其修

3、訂稿發(fā)表，比較詳細，具有可操作性。由于腦死亡是一個涉及醫(yī)學、倫理學、法學、社會學等多個學科的概念，盡管呼聲很高，我國實現(xiàn)腦死亡立法還有許多實際問題，但將是一種必然趨勢。
　　腦死亡供體是聯(lián)合國推薦優(yōu)先發(fā)展的器官移植供體，動物模型和臨床研究均已證明腦死亡是一個直接影響器官形態(tài)和功能的動態(tài)過程，其機制仍然不能完全明了。研究表明，腦死亡可引起心、腎細胞凋亡增加。進而引起形態(tài)改變和功能受損。2003年發(fā)表于《Transplantation

4、》雜志上的關于腦死亡的文章，進一步揭示腦死亡誘導肝細胞凋亡增加，且以肝實質細胞為主，其機制與死亡受體途徑和線粒體途徑均有關。另有多項研究證實，凋亡是造成腦死亡供體器官移植后生存力下降的原因之一。
　　最近的研究表明，內(nèi)質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERs）也是細胞凋亡調(diào)節(jié)中的重要環(huán)節(jié)之一。
　　內(nèi)質網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）在細胞內(nèi)分布廣泛，參與重要生理功能的

5、維持，主要負責蛋白質的合成轉運、信號肽識別、糖基化修飾等過程和鈣離子的貯存，信號轉導及細胞內(nèi)鈣的再分布。內(nèi)質網(wǎng)巨大的膜結構在細胞內(nèi)提供了一個寬廣的分子組裝、反應平臺，使之在多種信號調(diào)控中起到關鍵作用。內(nèi)質網(wǎng)的功能對大多細胞的活動和生存是必需的。
　　ERs途徑是獨立于細胞膜受體或線粒體途徑的第3條凋亡信號途徑。ER對諸如能干擾 ATP、氧化狀態(tài)及 Ca2+濃度等的內(nèi)環(huán)境改變非常敏感，這些改變會降低內(nèi)質網(wǎng)蛋白折疊能力，引起未折疊蛋白

6、的積累和聚集，從而激活未折疊蛋白反應( unfolded protein response，UPR)，以保護由ERs所引起的細胞損傷，恢復細胞功能。但當損傷超過修復能力時，ERs則引起細胞凋亡。以 ERs相關生物大分子作為靶點進行藥物研究將為相關疾病的預防和治療開辟新的途徑。許多肝臟疾病的發(fā)病機制均與ERs引起的損傷有關，但ERs是否參與、介導腦死亡狀態(tài)下肝損傷、肝細胞凋亡的過程至今未見文獻報道。如能證實 ERs參與了該過程的介導，并找

7、到針對 ERs途徑的干預措施來減輕肝損傷，將為腦死亡后器官功能保護提供新的思路，從而為臨床肝移植提供潛在的供體。
　　本課題擬分三個部分從組織及細胞水平揭示內(nèi)質網(wǎng)應激參與SD大鼠腦死亡狀態(tài)下肝損傷的分子機制。
　　第一部分：SD大鼠腦死亡模型的建立與維持
　　目的:
　　本研究擬在我們前期研究的基礎上進一步探索采用緩慢間歇顱內(nèi)加壓法模擬顱內(nèi)出血、腦疝形成建立穩(wěn)定的Sprague Dawley（SD）大鼠腦死亡模型

8、以及較長時間維持腦死亡狀態(tài)的方法，為研究SD大鼠腦死亡狀態(tài)下的肝臟形態(tài)和功能變化及其他相關基礎、臨床研究提供穩(wěn)定的實驗動物模型。
　　材料與方法:
　　實驗動物：成年，雄性，健康，SD大鼠，體重250g～350g，自由飲食。
　　實驗方法：顱骨鉆孔，硬腦膜外腔置入Fogarty3F氣囊導管，其尖端指向大鼠尾側，氣囊導管連接球囊壓力注射泵，通過向氣囊注入生理鹽水進行顱內(nèi)加壓，直至達到腦死亡狀態(tài)。
　　腦死亡判斷標準

9、：（1）深昏迷；（2）角膜反射消失；（3）瞳孔固定、散大；（4）靜息腦電圖；（5）自主呼吸消失。
　　觀察指標：全程記錄生命體征（心率HR、呼吸R、體溫T、血壓BP）、尿量、血流動力學、腦電圖、脈搏氧飽和度（SPO2）及其與顱內(nèi)壓變化的相關規(guī)律。
　　實驗分組：健康 SD大鼠隨機分為：①對照組（C組）：與腦死亡組對應，每個時間點n=10只，腹腔注射麻醉后隱動脈置管（24G靜脈留置針，行有創(chuàng)動脈血壓監(jiān)測）、氣管插管、顱骨鉆孔并

10、置入Fogarty3F導管，并實時監(jiān)測動脈壓、脈搏氧飽和度、體溫、腦電圖變化，顱內(nèi)不加壓不建立腦死亡模型；②腦死亡組(BD組)，按實驗設計分為腦死亡0h、1h、2h、4h、6h時間點組，每時間點組10只，除以上操作外，應用緩慢間歇顱內(nèi)加壓法建立腦死亡模型，通過呼吸、循環(huán)支持維持實驗動物腦死亡狀態(tài)0h、1h、2h、4h、6h，維持腦死亡狀態(tài)要求大鼠生命體征穩(wěn)定：實時監(jiān)測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP)≥80

11、mmHg，體溫38.1±0.2℃，脈搏氧飽和度≥95％，呼吸機機械通氣支持，適當增加吸入氣中氧含量，呼吸頻率、潮氣量由HARVARD動物呼吸機自動據(jù)體重計算參數(shù)，可適當微調(diào)整，腦電圖呈靜息狀態(tài)，血流動力學穩(wěn)定。
　　結果:
　　1.大鼠腦死亡模型的穩(wěn)定建立
　　采用緩慢間歇顱內(nèi)加壓法可模擬腦出血病理生理過程建立簡便、易重復的SD大鼠腦死亡模型，按實驗要求穩(wěn)定保持腦死亡狀態(tài)6h，為后續(xù)相關研究提供可靠的動物模型。模型建立

12、過程詳見圖1-2，3，4，5，6，7，8。
　　2.平均動脈壓(MAP)的變化
　　腦死亡各組顯示相似的平均動脈壓變化過程，并與文獻報道結果一致。腦死亡判定后，在呼吸機支持的情況下，適當調(diào)整吸入氣中氧濃度，腦死亡模型血流動力學穩(wěn)定，平均動脈壓維持在80mmHg以上，實驗全程不使用血管活性藥物。與對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。（圖1-14）
　　3.心率的變化
　　腦死亡過程心率出現(xiàn)典型的變化，每

13、個實驗組內(nèi)動物模型出現(xiàn)相同的變化過程，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見圖1-13。
　　4.腦電圖的變化
　　隨著緩慢顱內(nèi)加壓誘導開始，腦電活動開始紊亂，腦電壓不穩(wěn)定，隨著顱內(nèi)壓的增高，腦電活動逐漸減弱，漸成一直線。腦死亡組各時間點組均出現(xiàn)相似的腦電變化過程，與對照組比較，差異顯著。詳見圖1-10，11，12。
　　第二部分：探討腦死亡狀態(tài)下SD大鼠肝臟形態(tài)與功能的變化
　　目的:

14、　　觀察腦死亡狀態(tài)下SD大鼠肝臟形態(tài)與功能的變化特點，研究腦死亡對肝臟的影響。
　　方法:
　　腦死亡組SD大鼠在腦死亡判定后0h、1h、2h、4h、6h分別停止呼吸支持，剖腹，于下腔靜脈處抽靜脈血，室溫靜止、離心后取血清分裝凍存管后-20℃或-80℃凍存待測；取相同部位肝組織分別：①迅速置入凍存管液氮保存；②切成小顆粒狀（0.5-1mm3）置入4%戊二醛液固定，4℃冷藏備電鏡切片；③肝組織切成片狀（約1-2cm2大小，厚度

15、為0.2-0.3cm）放入中性福爾馬林溶液浸泡制成石蠟塊。應用全自動生化分析儀檢測血清肝臟酶學（ALT、AST）的變化；透射電鏡（TEM）觀察肝臟形態(tài)學變化；羅氏公司原位末端凋亡檢測試劑盒觀察肝組織凋亡細胞。對照組SD大鼠按上述時間點同樣方法取材。
　　結果:
　　1.腦死亡組大鼠0h、1h、2h、4h、6h不同時間點血清ALT、AST變化
　　腦死亡誘導判定后SD大鼠肝功能（ALT、AST）出現(xiàn)不同程度的變化，隨時間

16、的推移，ALT、AST呈逐漸升高趨勢，與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學意義（附表2-1）。
　　2.電鏡下觀察肝細胞形態(tài)結構變化
　　對照組 SD大鼠肝組織細胞未見明顯異常，腦死亡組 SD大鼠隨時間推移，肝組織結構出現(xiàn)損傷性變化，且逐漸加重，如輕度損傷為線粒體輕度腫脹，線粒體脊欠清晰，線粒體內(nèi)外膜破損（BD-2h），中度損傷表現(xiàn)為部分線粒體脊損傷（BD-4h），重度為線粒體脊融合，內(nèi)外膜破損，線粒體腫脹明顯，線粒體增生且膜性結

17、構融合（附圖2-1）。
　　3.肝組織肝細胞凋亡檢測
　　對照組大鼠肝臟TUNEL染色少見凋亡。腦死亡組，SD大鼠肝臟細胞凋亡數(shù)量明顯增加，且隨腦死亡維持時間的延長，肝細胞凋亡細胞逐漸增加（附圖2-2，3）。
　　第三部分：SD大鼠腦死亡過程是否啟動肝細胞內(nèi)質網(wǎng)應激；內(nèi)質網(wǎng)應激是否介導或參與腦死亡狀態(tài)下肝損傷、肝細胞凋亡過程
　　目的:
　　探討SD大鼠腦死亡過程是否啟動肝細胞內(nèi)質網(wǎng)應激，研究內(nèi)質網(wǎng)應激是否

18、介導或參與腦死亡狀態(tài)下肝損傷、肝細胞凋亡過程。
　　方法:
　　分別采用Western blot及實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）、免疫組化（immunohistochemistry，IHC），對各實驗組及不同時間點組肝組織標本進行 GRP78；XBP-1；CHOP；JNK；Caspase-12；ATF4基因及其部分蛋白表達分析

19、。
　　結果:
　　與對照組相比，腦死亡狀態(tài)下SD大鼠肝組織不同時間點隨時間推移內(nèi)質網(wǎng)應激相關大分子物質GRP78/BiP；XBP-1；CHOP/GADD153；JNK；Caspase-12；ATF4從基因水平均表達增加，其中 GRP78、CHOP、XBP-1、Caspase-12蛋白表達明顯增加，初步表明腦死亡過程誘導 SD肝組織損傷，并啟動內(nèi)質網(wǎng)應激、未折疊蛋白反應，參與肝細胞損傷過程，差異具有顯著性，具有統(tǒng)計學意義。（