UBASH3A和UBASH3B基因單核苷酸多態(tài)性及mRNA表達與SLE的關聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic Lupus Erythematosus，SLE）為系統(tǒng)性自身免疫性疾病中的一種，以產生各種自身抗體，免疫復合物累積以及體內多種器官、組織急性和慢性炎癥為其主要特征，且臨床表現(xiàn)各異，可從輕微的臨床癥狀（如皮疹或非侵蝕性關節(jié)炎）到危及生命的全身各臟器受累（如狼瘡腎炎，神經精神紊亂等）。目前其病因尚未明確，可能是遺傳因素、環(huán)境因素及交互作用等共同影響，而引起一系列異常免疫反應的結果。

2、r>　　SLE患病率在不同地區(qū)和種族人群中不相一致。在美國，SLE的患病率在15-144/10萬之間，瑞典人群 SLE患病率在46-85/10萬；韓國 SLE患病率在18.8-21.7/10萬，中國人群SLE患病率約70/10萬，而香港人群SLE患病率約為60/10萬。有證據表明，遺傳因素在此病的致病機制上起著重要作用。全基因組關聯(lián)研究（Genome-Wide Association Studies，GWAS）和候選基因的研究在鑒別系統(tǒng)

3、性紅斑狼瘡風險基因位點上已取得不少進展，也為多基因遺傳性疾病致病機制的探索以及發(fā)展具有潛力靶點藥物的選擇提供了依據。當前，經遺傳缺失角度研究SLE的致病機制已成為相關研究的熱點。
　　蛋白酪氨酸磷酸酶（Protein Tyrosine Phosphatase，PTPs）是調節(jié)細胞信號通路中的關鍵酶。蛋白酪氨酸磷酸化在包括細胞生長、分化、突觸傳遞、遷移、糖代謝以及免疫反應等在內的眾多重要生理進程中發(fā)揮著作用。第一個 PTP序列大約在

4、26年前被發(fā)現(xiàn)，目前人類基因家族大約有100余種基因；蛋白酪氨酸磷酸化主要是由PTPs和蛋白酪氨酸激酶（Protein Tyrosine Kinases，PTK）相互進行控制的。PTPs在體內活性的調節(jié)伴隨著多種機制，包括信使RNA（Messenger RNA，mRNA）的選擇性剪切、調節(jié)蛋白質穩(wěn)態(tài)水平、二聚化和翻譯后修飾和亞細胞定位等。PTPs參與以酪氨酸磷酸化為基礎的細胞信號轉導功能中的調節(jié)，通過胞內蛋白中的酪氨酸殘基去磷酸化而起作

5、用。PTPs作為PTK的天然拮抗劑，可以通過抑制T細胞受體信號通路，在調節(jié)T細胞功能和免疫穩(wěn)態(tài)中起到作用。近年來，有證據表明PTPs家族相關基因參與多種細胞信號通路，其活性失衡可能參與人類自身免疫性疾病、糖尿病、肺結核及癌癥等疾病的發(fā)生。攜帶有與疾病相關的單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs）位點的PTPs可能將成為良好的候選基因，這也許與它們參與了抑制自發(fā)性 T細胞激活，通過去磷酸化

6、，使T細胞相關激酶以及它們的底物失活而抑制反應有關。
　　UBASH3A(也稱為TULA或STS-2)和UBASH3B(也稱為TULA-2或STS-1)是新近發(fā)現(xiàn)的PTPs家族成員，可能為具有多種細胞功能的新型調節(jié)劑；它們編碼 TULA家族蛋白，在 T細胞和血小板中可下調受體介導的信號通路。TULA蛋白家族具有40％的序列相同性。UBASH3B基因廣泛表達于機體各組織，而UBASH3A基因則主要在脾、腎、肺、骨髓等器官以及外周血淋

7、巴細胞、造血細胞中表達。這兩種蛋白氨基酸序列中均擁含有一個N-末端的與泛素相關的結構；中間的Src同源3（SrcHomology3，SH3）結構域，介導與富含脯氨酸的CBL相結合，以及C-末端的磷酸甘油酸變位酶（Phosphoglycerate Mutase，PGM）結構域可介導蛋白二聚化（見圖1）。
　　現(xiàn)有GWAS和侯選基因的遺傳關聯(lián)研究提示，UBASH3A和UBASH3B基因SNPs可能與多種不同的自身免疫性紊亂，如Ⅰ型糖尿

8、病、白癜風、類風濕性關節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乳糜瀉、實驗性自身免疫性腦膜炎、白塞病等存在關聯(lián)，但結論不盡一致。如在英國和丹麥人群發(fā)現(xiàn)UBASH3A基因與Ⅰ型糖尿病存在遺傳易感性關聯(lián)，但在丹麥、法國、德國等多個國家RA病人開展的遺傳易感性研究和Meta分析未能驗證UBASH3A基因與度、主要臨床特征以及實驗室指標的關系。探討上述基因mRNA表達在SLE致病機制中可能發(fā)揮的作用。
　　

9、綜上，我們通過分析基因單核苷酸多態(tài)性及mRNA表達與SLE患病的關聯(lián)性結果來驗證UBASH3A和UBASH3B基因與中國人群 SLE發(fā)病的關聯(lián)性，并且假設不同臨床特征 SLE患者UBASH3A和UBASH3B的表達存在差異，推測UBASH3A和UBASH3B可能是需要經探索的基因治療靶點，進而為 SLE病患早期發(fā)現(xiàn)以及臨床決策提供參考依據。
　　目的：
　　探討SLE患者和健康對照UBASH3A基因(rs3788013，rs

10、2277798，rs1893592和rs11203203)和UBASH3B基因rs4936742位點與中國人群SLE遺傳易感性的關聯(lián)；同時結合調查問卷資料探討相關 SNP位點多態(tài)性與主要臨床特征以及實驗室指標之間的聯(lián)系；比較 SLE病例和健康對照之間，SLE并發(fā)LN病例和非LN病例，不同疾病活動期病例外周血單個核細胞UBASH3A和UBASH3B基因mRNA表達水平差異，分析其與疾病活動度、主要臨床特征以及實驗室指標的關聯(lián)，并探討上述基

11、因多態(tài)性及基因轉錄水平在SLE發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　用于基因分型的研究對象1569例，其中SLE病例組樣本792例，收集來自安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院和安徽省立醫(yī)院風濕免疫科的門診以及住院患者問卷資料和血樣 DNA。病例的診斷由兩名副主任醫(yī)師以上級別的專科醫(yī)師確診，且均符合美國風濕病學會1997年修訂的 SLE分類標準；同時與其它疾病，如惡性網狀內皮細胞增多癥、溶血性貧血、血小板減少癥和結締組織病等進行鑒別，排

12、除非SLE病例。研究對象收集時間范圍2012年9月-2014年10月，歷時約兩年多，并排除復診的SLE病例和不配合者。
　　用于基因分型的健康對照777例，來自健康體檢中心和安徽醫(yī)科大學的健康獻血者，且排除SLE和其它的自免病史，被調查前一個月身體健康，無重大疾病史的獻血人群。另在上述兩所三甲醫(yī)院中選取用于mRNA分析的研究對象62例，其中32例SLE病例和30例健康對照，其分類診斷和納入排除標準同上。對照為年齡、性別與病例具有可

13、比性的健康獻血者。
　　采用本課題組設計的問卷進行資料收集，內容包括（研究對象人口學特征、臨床特征以及實驗室檢測結果等），由經過統(tǒng)一培訓的調查員采用面對面訪視的方式收集 SLE患者的相關資料，并結合醫(yī)院電子病歷信息系統(tǒng)進行資料補充；同時，提取所有被調查對象的外周靜脈血各5ml，利用Fluidigm192.24 Dynamic Array儀以及TaqMan探針進行基因分型檢測，分析UBASH3A和UBASH3B基因5個SNP位點的單

14、核苷酸多態(tài)性；比較在SLE病例組和對照組，LN病例組與非 LN病例組中各 SNP位點的基因型、等位基因的頻率分布情況，對顯性模型和隱性模型進行分析和計算；分析各位點 SNP多態(tài)性與相關臨床特征和實驗室指標的關系。應用RT-qPCR分析PBMC中UBASH3A和UBASH3B基因mRNA的表達情況，采用Mann-Whitney U檢驗比較組間差異，利用Spearman等級相關分析 UBASH3A和UBASH3B基因 mRNA表達水平與臨床

15、資料及實驗室指標的關聯(lián)。
　　利用SPSS11.5軟件進行卡方檢驗，統(tǒng)計學關聯(lián)強度用比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表達，并且用Logistic回歸分析計算經年齡和性別校正后的OR值和95% CI；檢驗效能和所需樣本量估算用Power and Sample Size Calculation軟件，基因單倍型分析采用在線SHEsis軟件。檢驗水準α假定為0.05。

16、r>　　結果：
　　（1）本研究 UBASH3A rs3788013，rs2277798，rs1893592，rs11203203和UBASH3B rs4936742五個位點的基因型分布在病例組和對照組均達到HWE平衡（P>0.05）。
　　（2） UBASH3A和UBASH3B基因多態(tài)性與SLE遺傳易感性關聯(lián)研究結果表明，UBASH3A基因rs3788013位點與SLE遺傳易感性存在統(tǒng)計學關聯(lián)（A vs. C：χ2=9.0

17、16，P=0.003，OR=0.795，95% CI0.684-0.924；AA vs. CC：χ2=5.965，P=0.015，OR=0.632，95% CI0.437-0.913；CA+AA vs. CC：χ2=5.736，P=0.017，OR=0.770，95% CI0.622-0.954）。UBASH3A基因rs2277798位點，rs1893592位點和rs11203203位點等位基因及基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.

18、05）。另外，LN與非 LN病例在各位點等位基因及基因型頻率分布之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。UBASH3B基因位點 rs4936742等位基因及基因型頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　?。?）UBASH3A基因單倍型分析由UBASH3A基因rs2277798，rs11203203，rs3788013以及rs1893592四個位點構建的單倍型在中國人群中存在七種常見單倍型結構結果顯示，GGCA單倍型頻率SLE病

19、例組高于對照組(χ2=10.155，P=0.001，OR=1.61，95% CI1.20-2.17)；此外，SLE病例組GGAA單倍型頻率明顯低于對照組(χ2=6.221，P=0.012，OR=0.81，95% CI0.68-0.96)。
　?。?）SNP位點與臨床特征的關聯(lián)性結果顯示，SLE合并血管炎病例中，rs3788013位點 AC基因型頻率高于不伴有血管炎病例(χ2=8.837，P=0.012)；rs2277798位點 A

20、G基因型頻率在 SLE病例合并血尿者高于未伴血尿者(χ2=11.569，P=0.003)；rs1893592位點等位基因頻率與 SLE病例是否患口腔潰瘍存在統(tǒng)計學關聯(lián)(χ2=5.301，P=0.021，OR=0.671，95% CI0.477-0.944)，與是否合并關節(jié)炎存在關聯(lián)(χ2=4.803，P=0.028，OR=0.765，95% CI0.602-0.972)，與病例是否合并皮疹之間存在關聯(lián)(χ2=4.130，P=0.042，

21、OR=0.776，95% CI0.608-0.991)?？?ds-DNA陽性患者的 rs4936742位點 TC基因型頻率高于抗ds-DNA陰性者(χ2=7.410，P=0.025)。
　?。?）UBASH3A mRNA表達情況及與主要臨床表型關聯(lián) SLE病例 PBMC中UBASH3A mRNA表達表達水平較健康對照組低（P=0.002），活動期 SLE病例組低于非活動期組（P=0.000），但狼瘡腎炎組病例與非狼瘡腎炎病例表達無

22、統(tǒng)計學差異（P>0.05）。SLE病例UBASH3A mRNA表達與白細胞降低、抗dsDNA抗體陽性以及抗 SSB抗體陽性存在負相關（rs=-0.380，P=0.032；rs=-0.385，P=0.030；rs=0.433，P=0.013），而SLE病例UBASH3A mRNA水平與其它臨床癥狀如關節(jié)炎、發(fā)熱、脫發(fā)等均未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學關聯(lián)（P>0.05）；SLE病例UBASH3A mRNA表達與病例首次發(fā)病年齡相關（rs=-0.358，P=

23、0.044）；SLE病例UBASH3A mRNA水平與SLEDAI呈負相關（rs=-0.350，P=0.049）。
　?。?） UBASH3B mRNA表達情況及與主要臨床表型關聯(lián)本研究未發(fā)現(xiàn)UBASH3B基因mRNA表達水平在病例組與對照組，活動組與非活動組，腎炎病例組與非腎炎病例組以及與臨床表型、SLEDAI之間具有相關性（P>0.05）。
　　結論：
　　UBASH3A基因位點 rs3788013多態(tài)性可能與漢族

24、人群 SLE患病遺傳易感性有關。UBASH3A基因位點構建的單倍型GGCA可能增加SLE的患病風險，GGAA可能降低SLE的患病風險。rs3788013位點可能與SLE合并血管炎有關；rs1893592位點可能與 SLE合并口腔潰瘍、關節(jié)炎及皮疹有關；rs2277798位點可能與SLE合并血尿有關；rs4936742位點可能與SLE合并抗ds-DNA增加有關。SLE病例UBASH3A mRNA表達水平降低，且與部分臨床表型如白細胞下降、