慢性乙肝中醫(yī)濕熱中阻、肝郁脾虛、瘀血阻絡證蛋白質(zhì)組學初步研究.pdf

1、目的:利用雙向電泳技術分離慢性乙型病毒性肝炎(慢性乙肝)中醫(yī)濕熱中阻、肝郁脾虛和瘀血阻絡三證型患者外周血總蛋白,建立相應蛋白質(zhì)圖譜。對差異表達的蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索,比較各證型差異表達的蛋白質(zhì),初步確定在三個證型中差異表達的蛋白質(zhì)。通過對差異表達蛋白質(zhì)與證候關系的分析,初步探索出慢性乙肝濕熱中阻、肝郁脾虛和瘀血阻絡證型的蛋白質(zhì)組學規(guī)律,為中醫(yī)臨床辨識慢性乙肝中醫(yī)證候提供可供參考的客觀化指標,最終為進一步探討慢性乙肝中醫(yī)證候本質(zhì)

2、提供科學依據(jù)。
　　 方法:按照《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準》,在瀘州醫(yī)學院附屬中醫(yī)醫(yī)院2008年10月-2009年5月期間慢性乙肝住院病人中收集典型的肝郁脾虛證(4例)、濕熱中阻證(4例)和瘀血阻絡證(3例)共11例做為觀察組,以健康正常人2例為對照組。通過對雙向電泳技術中的一些環(huán)節(jié)探索如血漿的提取,上樣量的選擇,電泳參數(shù)的設置,凝膠的濃度和染色方法的改進,在PH4-7的IPG凝膠干膠條,以約130μg的上樣量,75000v.h的

3、電泳條件下,初步建立了慢性乙肝血漿的雙向電泳體系。并且得到了分辨率好的差異蛋白表達圖譜。掃描凝膠成像,以ImageMaster2D軟件分析肝郁脾虛組、濕熱中阻組、瘀血阻絡組與健康人對照組血漿表達圖譜。實驗組與對照組標準化總灰度值(％Vol)相差達2倍以上的蛋白斑點視為差異表達蛋白點,切取相應的差異表達蛋白質(zhì)點,進行基質(zhì)輔助的激光解析飛行時間質(zhì)譜(MADLDI-TOF-MS)檢測,結合2-DE圖譜中各蛋白質(zhì)點的相對等電點(pI)、相對分子

4、量(Mw)與Swiss-prot蛋白數(shù)據(jù)庫的匹配檢索,鑒定出各差異表達的蛋白質(zhì)。
　　 結果:(1)獲得了分辨率和重復性均較好的慢性乙肝病濕熱中阻組、肝郁脾虛組、瘀血阻絡組及健康人對照組血漿蛋白質(zhì)組表達雙向電泳銀染圖譜。健康人平均蛋白點數(shù)為(290±17)個,CHB濕熱中阻證(350±23)個,CHB肝郁脾虛證(328±14)個,CHB瘀血阻絡證(489±25)個。(2)差異蛋白點質(zhì)譜鑒定,共發(fā)現(xiàn)10種蛋白。其功能涉及免疫,脂類

5、代謝,炎癥反應等。與正常人比較,在濕熱中阻證有5個蛋白表達下調(diào),5個蛋白表達上調(diào)；在肝郁脾虛證有4個蛋白表達下調(diào),6個蛋白表達上調(diào)；在瘀血阻絡證型有4個蛋白表達下調(diào),6個蛋白表達上調(diào)。這些蛋白點中表達上調(diào)的有血清淀粉蛋白P(SAMP)、免疫球蛋白J鏈(IGJ)、C反應蛋白(CRP),表達下調(diào)的有結合珠蛋白(Hp),前白蛋白,載脂蛋白C(apoC)等。
　　 結論:(1)初步建立慢性乙肝肝郁脾虛組、濕熱中阻組、瘀血阻絡組及健康人對

6、照組血漿蛋白質(zhì)組表達圖譜。(2)慢性乙肝肝郁脾虛證組、濕熱中阻證組、瘀血阻絡證組和健康對照組存在多個蛋白質(zhì)表達差異,表明CHB存在多蛋白表達異常。慢性乙肝不同證型間存在多個差異表達蛋白提示同病異證具有不同的物質(zhì)基礎(不同的蛋白質(zhì)),此為中醫(yī)“證”本質(zhì)研究奠定了科學基礎。(3)在濕熱中阻證中差異表達的蛋白質(zhì)主要屬于急性時相蛋白和脂類代謝有關的蛋白質(zhì)。其中載脂蛋白C的表達升高可能與此證型中細胞膜損害明顯而改變其結合位點有關。(4)肝郁脾虛證