長循環(huán)SPIO脂質體的合成及與SPIO在MRI淋巴成像的對比研究.pdf

1、研究目的：
　　 1.嘗試制備長循環(huán)SPIO(Superparamagnetic Iron Oxide)脂質體,優(yōu)選出最佳制備方案,并對并對其粒徑大小、粒徑分布進行表征；透射電鏡來測定其形態(tài)和大小；
　　 2.建立新西蘭大白兔反應性增生及 VX2 轉移淋巴結模型,經(jīng)耳緣靜脈注射長循環(huán)SPIO脂質體,進一步評估其淋巴組織靶向增強及長循環(huán)效果,并與傳統(tǒng) SPIO網(wǎng)狀內皮陰性對比劑對比,評估兩者在 MR 淋巴成像中對良、惡性淋

2、巴結診斷和鑒別診斷的價值。
　　 材料和方法
　　 一、長循環(huán)SPIO脂質體的制備及表征
　　 (一)制備工藝的確定
　　 精密稱取一定量的Feso4與Fecl3堿性條件下反應后用氨水洗滌,加入1g月桂酸攪拌無沉淀后加熱數(shù)分鐘,于500ml的TES緩沖液透析2天,每隔8小時換液。另取DSPG 和DSPE-PEG2000溶于氯仿,于恒溫磁力攪拌器內攪拌至澄清后,置于三頸瓶中沖氮氣吹干氯仿,成膜后加入20ml

3、 TES 緩沖液,超聲震蕩分散后,4℃條件下離心 10000 轉/分,10min,取上清,得到空白脂質體?？瞻字|體和吸附月桂酸的SPIO 混合后透析3天后,凝膠過柱后置于4℃冰箱備用。
　　 (二)空白脂質體及長循環(huán)SPIO 脂質體粒徑及其分布的測定用 Malvern-3000HS 激光粒度分析儀測定粒徑及其分布:吸取5ul制備的相應樣品,用雙蒸水稀釋至量杯中。所選激光光源波長為 633.0nm,測試溫度為 25.00±0.0

4、5。
　　 (三)空白脂質體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO及長循環(huán)SPIO 脂質體的形態(tài)觀察用透射電鏡(日立 H-600)觀察空白脂質體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO及長循環(huán)SPIO 脂質體大體形態(tài)。具體操作方法為:1:4蒸餾水稀釋純凈空白脂質體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO 及長循環(huán) SPIO 脂質體液體,取 1 滴放在鍍膜銅網(wǎng)上,濾紙吸去多余液體,加入2％磷鎢酸染30s,干燥后電鏡下觀察。
　　 (四)長循環(huán)SPIO脂質體鐵含量的測定采用臨

5、二氮菲法測量長循環(huán)SPIO脂質體中鐵含量。
　　 (五)X射線衍射分析分別取真空干燥的月桂酸穩(wěn)定的SPIO納米微粒和長循環(huán)SPIO脂質體納米顆粒研細,置于射線粉末(多晶)衍射儀中。將所得的圖譜與國際粉末衍射標準聯(lián)合會出版的PDF卡片比較,以此來確定樣品所具備的晶體結構。
　　 二、靜脈注射長循環(huán)SPIO脂質體及傳統(tǒng)SPIO在MR淋巴成像中對照研究
　　 (一)實驗動物分組
　　 健康成年新西蘭白兔24只,

6、由空軍醫(yī)院動物實驗中心提供,體重2.0～2.5kg,采用隨機法分為 2 組:反應性增生淋巴結組(n=12)、VX2 腫瘤轉移淋巴結組(n=12)。
　　 (二)動物模型建立
　　 單側肌肉注射0.5ml蛋黃乳膠于新西蘭白兔后腿,用于建立反應性增生淋巴結模型。從 VX2 荷瘤種兔取生長活躍的腫瘤組織,研磨成混懸液,抽取 0.5ml(濃度大約107/ml)混懸液單側后腿肌肉接種于新西蘭大白兔,用于建立 VX2 肉瘤淋巴結轉移

7、模型。
　　 (三)MRI掃描
　　 1、平掃:MRI 掃描采用頭部線圈,掃描序列及參數(shù)為:T1WI(TR/TE=539/14ms)橫斷位及矢狀位,T2WI(TR/TE=2234/85ms)橫斷位及矢狀位。
　　 2、增強掃描
　　 1、反應性增生淋巴結組:采用隨機法將反應性增生淋巴結組的新西蘭大白兔分成長循環(huán)SPIO脂質體增強Ⅰ組(n=6)和SPIO增強Ⅱ組(n=6)。在平掃完畢后,在平掃完畢后,在增強

8、增強Ⅰ組新西蘭白兔耳緣靜脈注射0.5ml的長循環(huán)SPIO脂質體,在增強Ⅱ組注射0.5ml 20umol Fe/ml的SPIO,掃描時間為給藥后 15 分鐘、30 分鐘、60分鐘、4小時,24小時、48小時進行掃描,掃描參數(shù)同平掃。
　　 2.、腫瘤淋巴結轉移增生組:將腫瘤轉移淋巴結組分為長循環(huán)SPIO脂質體增強Ⅰ組(n=6)和SPIO增強Ⅱ組(n=6)。對比劑注射劑量及方式同反應性增生淋巴結組,掃描時間為給藥后15分鐘、30分鐘

9、、60分鐘、4小時,24小時、48小時進行掃描,掃描參數(shù)同平掃。
　　 (四)圖像評估
　　 1、測量淋巴結大小
　　 在 T1WI 像上,測量各組腘窩后淋巴結的短徑,以均數(shù)±標準差表示,并與淋巴結病理解剖標本的實測值作對照。
　　 2、在不同序列上分別測量平掃、增強后腘窩淋巴結的信號強度,測背景噪聲的標準差(Standard deviation of the noise,SDN)。計算各組淋巴結的信噪比

10、(Signalto noise ratio.SNR)
　　 (五)病理組織學檢查
　　 所有實驗動物在完成 MRI 增強掃描后,用靜脈過量麻醉法處死動物,仔細暴露腘窩淋巴結,摘除并測量淋巴結的短徑,計算淋巴結數(shù)目。然后用 10～15％中性福爾馬林浸泡、固定,常規(guī)石蠟包埋,切片后行 H-E 染色觀察淋巴結形態(tài)和結構的變化,判別其良惡性。
　　 (六)統(tǒng)計學分析
　　 應用 SPSS13.0 軟件包,采用兩獨

11、立樣本 t 檢驗評價平掃各組不同序列淋巴結的SNR、組間各序列圖像上長循環(huán) SPIO、SPIO 增強后淋巴結 SNR 是否有顯著性差異。P<0.05 認為有顯著性差異。
　　 結果
　　 一、空白脂質體、月桂酸穩(wěn)定的SPIO及長循環(huán) SPIO 脂質體脂質體的表征
　　 1.透射電鏡下空白脂質體平均粒徑約20nm,月桂酸穩(wěn)定的SPIO 平均粒徑約12nm,長循環(huán) SPIO 脂質體平均粒徑約為 60nm。
　　

12、 2.透射電鏡觀察空白脂質體呈類圓形、空泡狀,大小分布較均勻,表面光滑,粒子間無粘連。月桂酸穩(wěn)定的SPIO 呈類圓形、形態(tài)規(guī)則、大小均勻的顆粒,可見少許團聚現(xiàn)象。長循環(huán) SPIO 脂質體呈類圓形,大小均勻,表面平滑完整,粒子之間無粘連,可見殼-核結構。
　　 3.X 射線衍射分析:月桂酸穩(wěn)定的SPIO 納米微粒和長循環(huán) SPIO 脂質體納米微粒的衍射圖說明產物均為面心立方尖晶石結構的Fe3O4,而且粒子的結晶狀態(tài)很好。

13、　　 4.用 Malvern-3000HS 激光粒度分析儀測定的長循環(huán) SPIO 脂質體測定數(shù)據(jù)為:強均粒徑 di=78.7nm；體均粒徑 dv=76.7nm；數(shù)均粒徑 dn=73.5nm,峰面積:100％,峰數(shù)為 1；多分散系數(shù)(Poly.index)為 0.212。
　　 5.鐵的標準曲線方程:A=0.1947C+0.0008,R2=0.9982。測得長循環(huán) SPIO 脂質體的鐵含量為 6.7213mg/ml。
　　

14、 二、模型的建立及病理表現(xiàn)
　　 1、反應性增生淋巴結和腫瘤轉移性淋巴結均制作成功,在 T1WI 上的SNR 均無顯著性差異(t=-0.352,P=0.732)及 T2WI 圖像中 SNR 亦無顯著性差異(t=-0.924,P=0.377),平掃兩組腘窩淋巴結短徑無顯著性差異(t=-1.373,P=0.200),但腫瘤轉移性淋巴結平均直徑大于反應性增生淋巴結。
　　 2、各組腘窩淋巴結平掃信號特點在 T1WI 像上,相

15、對于肌肉及脂肪,各組淋巴結均呈稍高信號,在 T2WI 像上,各組淋巴結均呈較高信號。
　　 3、靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質體及 SPIO后各組淋巴結MRI 表現(xiàn)
　　 (一)反應性增生淋巴結組:耳緣靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質體后,與平掃相比,腘窩淋巴結在 T2WI 像上信號可見較明顯降低,信號降低較均勻。耳緣靜脈注射SPIO 后,與平掃相比,腘窩淋巴結在 T2WI 信號降低不明顯。
　　 (二)腫瘤轉移性

16、淋巴結組:耳緣靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質體后,與平掃相比,腘窩淋巴結在 T2WI 像上,腘窩淋巴結表現(xiàn)為陰性不均勻強化。耳緣靜脈注射 SPIO后,與平掃相比,腘窩淋巴結在 T2WI 信號降低不明顯。
　　 結論
　　 1、長循環(huán) SPIO 脂質體的粒徑大小適宜,大體形態(tài)呈類圓形,可見殼-核結構。
　　 2、靜脈注射長循環(huán) SPIO 脂質體可用來進行 MRI 淋巴造影。
　　 3、傳統(tǒng) SPIO 由于半