人臍帶間充質干細胞免疫調節(jié)機制的研究.pdf

1、第一部分:人臍帶間充質干細胞與外周血單個核細胞的相互作用:IL-1β、TNF-α、IFN-γ與細胞死亡
　　背景:間充質干細胞因其具有長期體外擴增、多項分化潛能和免疫調節(jié)作用，成為用于細胞基礎的組織修復和自身免疫性疾病治療極有前景的種子細胞。臍帶間充質干細胞分離自臍帶，與骨髓間充質干細胞相比，其涉及倫理問題較少。并且與分離自其他成體組織的間充質干細胞相比，相對更原始，是一種介于胚胎干細胞和成體干細胞間的一種細胞。臍帶間充質干細胞易

2、于分離、增殖能力強、不會誘發(fā)畸胎瘤并具有較強的免疫抑制能力，因此，臍帶間充質干細胞成為一種更有應用前景的間充質干細胞。另一方面，近期研究報道，間充質干細胞的免疫調節(jié)作用并不是固有的，其免疫調節(jié)作用的發(fā)揮與所處的微環(huán)境密切相關。目前人們對微環(huán)境對MSCs免疫調節(jié)作用發(fā)揮的研究相對較少。
　　目的:我們前期研究發(fā)現，單個核細胞(PBMCs)產生IL-1β參與hUC-MSCs的免疫調節(jié)作用。因此，在本研究中，我們致力于研究在MSCs病理

3、生理和治療條件下與其密切相關的PBMCs對MSCs免疫調節(jié)作用的影響及其機制。
　　方法:(1)分離臍帶間充質干細胞，并行流式細胞術進行免疫表型鑒定。(2)在誘導培養(yǎng)條件下，經茜素紅染色和油紅O染色，進一步鑒定間充質干細胞三系分化能力。(3)建立PBMC CM刺激hUC-MSCs最佳培養(yǎng)條件，并利用最佳培養(yǎng)條件，比較hUC-MSCs與BM-MSCs與PBMCs CM作用后表達細胞因子的差異。同時通過檢測不同培養(yǎng)上清中相關細胞因子含

4、量，尋找PBMCs對hUC-MSCs作用的重要細胞因子。(4)應用重組細胞因子IL-1β、TNF-α以及相關信號通路抑制劑(LY2940002、JNK inhibitorⅡ、BAY11-7082、SC-514、U0126、SB203580)作用細胞，通過檢測IL-6與MCP-1的表達比較IL-1β與TNF-α對hUC-MSCs表達細胞因子的差異。(5)應用重組細胞因子TNF-α、IFN-γ、TRAIL以及FasL，分別通過CellTit

5、er Glo(R)Luminescent Cell Viability Assay以及PI和FITC-Annexin雙染觀察不同細胞因子對hUC-MSCs死亡的作用，并同時檢測上清中IL-6與MCP-1的表達，研究細胞死亡與細胞因子分泌的關系。在部分實驗中，加入pan-caspase抑制劑zVAD-fmk(V，20μM)或RIP1抑制劑necrostatin-1(N，50μM)，研究不同細胞因子誘導hUC-MSCs細胞死亡的機制。(6)

6、應用凋亡蛋白抑制蛋白小分子拮抗劑GDC-0152處理經TNF-α刺激的hUC-MSCs，分別行共聚焦染色、分別提取細胞核與細胞漿進行免疫印跡，同時收集處理細胞上清行IL-6與MCP-1檢測，探討TNF-α促進hUC-MSCs分泌細胞因子的機制。
　　結果:(1)人臍帶間充質干細胞表達CD44、CD73、CD90和CD105，不表達CD34、CD19、CD31、CD45以及HLA-DR（HLA-Ⅱ類分子）。在體外誘導培養(yǎng)條件下，具有

7、三系分化的能力，符合國際細胞治療協會間充質與組織干細胞委員會規(guī)定的基本標準。(2)5×104/ml PBMCs培養(yǎng)24小時后的條件培養(yǎng)上清具有最佳的刺激效果，在后續(xù)PBMC CM刺激實驗中，均采用這一培養(yǎng)體系。(3) hUC-MSCs經PBMC CM刺激所表達的細胞因子與BM-MSCs相似，但其IL-1β和GM-CSF的表達量高于BM-MSCs。(4)在PBMCs通過可溶性細胞因子對MSCs的作用中，IL-1β是主要的調節(jié)因子，TNF-

8、α亦參與hUC-MSCs細胞因子的表達。并且IFN-γ可增強以上兩種因子對hUC-MSCs相關細胞因子的分泌。此外，PBMCs分泌TNF-α受IL-1β的調控。(5)高濃度的TNF-α可誘導hUC-MSCs發(fā)生死亡。死亡受體配體FasL本身以及與TNF-α聯合使用并不誘導hUC-MSCs死亡，但是TRAIL可增強TNF-α誘導的細胞死亡。并且IFN-γ亦可增強TNF-α誘導的細胞死亡，但其與TRAIL作用的機制不同。當TNF-α與TRA

9、IL聯合使用時，主要通過凋亡導致細胞死亡;而當IFN-γ與TNF-α聯合使用時，主要通過壞死導致細胞死亡。(6) TNF-α刺激hUC-MSCs分泌MCP-1和IL-6部分與細胞死亡間接相關，并且與凋亡蛋白抑制蛋白依賴的NF-kB活化相關。
　　結論:在PBMCs可溶性細胞因子對hUC-MSCs的作用中，IL-1β和TNF-α是兩個重要的細胞因子。其中，IL-1β是這一作用的主要細胞因子，并可促進PBMCs分泌TNF-α。低濃度的

10、TNF-α有助于hUC-MSCs分泌IL-6與MCP-1。當TNF-α濃度增加或與TRAIL和IFN-γ聯用時，TNF-α可誘導hUC-MSCs死亡，且與IL-6以及MCP-1的分泌相關。高濃度TNF-α促進hUC-MSCs分泌細胞因子與IAPs依賴的NF-kB信號通路活化相關。明確局部微環(huán)境中這些重要因子的相互作用有利于了解MSCs在維持組織穩(wěn)態(tài)中的生理與病理作用。
　　第二部分:人臍帶間充質干細胞誘導CD4+Ⅰ型調節(jié)性T細胞發(fā)

11、揮其免疫調節(jié)作用
　　背景:間充質干細胞因其具有免疫調節(jié)作用而被廣泛用于治療免疫相關疾病。人臍帶間充質干細胞因其具有易于取材、體外擴增速度快且無倫理問題，成為一種具有較好前景的臨床治療細胞。間充質干細胞免疫調節(jié)作用的發(fā)揮與可溶性細胞因子、細胞細胞間直接接觸以及誘導調節(jié)性T細胞產生均相關。另一方面，研究發(fā)現，Tr1是一種高表達IL-10，不表達Foxp3，具有較強免疫調節(jié)作用的調節(jié)性T細胞。目前尚不清楚，hUC-MSCs對這類調節(jié)性

12、T細胞的作用。
　　目的:通過hUC-MSCs與PBMCs共培養(yǎng)體系，探討Tr1產生在hUC-MSCs免疫調節(jié)中的作用及其機制。
　　方法:(1)應用流式細胞術對分離的人臍帶間充質干細胞進行表型分析。并在誘導培養(yǎng)條件下，行茜素紅染色與油紅O染色，觀察其成骨與成脂能力，鑒定MSCs。(2)建立共培養(yǎng)和transwell培養(yǎng)體系。將生長狀態(tài)良好的間充質干細胞以105-2×105/well接種于6孔板，待細胞貼壁后，經X光照射(5

13、4Gy)抑制其增殖。隨后以PBMCs與MSCs比例為10∶1的比例加入健康人新鮮分離的PBMCs進行共培養(yǎng)。在有些實驗組加入5μg/ml的植物血凝素，用于刺激PBMCs。(3)培養(yǎng)結束后，收集細胞，加入PE-antiCD4(Sk3，1∶100)、FITC-antiCD49b(AK7，4∶100)、APC-antiLAG3(FAB2319A,4∶100)以及preCP-Cy5.5-antiCD45RA(MI100,1∶100)抗體對細胞進

14、行染色，經流式細胞術分析hUC-MSCs誘導Tr1產生情況。(4)將培養(yǎng)結束后的細胞經流式細胞儀進行分選，分別收集CD49b-/LAG3-以及CD49b+/LAG3+的細胞，調整細胞密度，以105/孔接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集上清，進行IL-10 ELISA檢測。(5)收集共培養(yǎng)后細胞，進行細胞內IL-10染色，確定分泌IL-10細胞的來源。
　　結果:(1)人臍帶間充質干細胞表達CD44、CD73、CD90和CD10

15、5，不表達CD34、CD19、CD31、CD45以及HLA-DR（HLA-Ⅱ類分子），并在體外誘導條件下，具有三系分化的能力，符合見國際細胞治療協會間充質與組織干細胞委員會規(guī)定的基本標準。(2)將PBMCs與hUC-MSCs共培養(yǎng)，hUC-MSCs可誘導Tr1的產生。無論PBMCs是否活化（經植物血凝素刺激），與單獨PBMCs培養(yǎng)組相比，hUC-MSCs均可誘導Tr1產生(無PHA組，2.8±0.41 vs4.59±0.53; PHA刺

16、激組，3.107±0.19 vs.11.07±0.85，p＜0.05)。(3)通過transwell培養(yǎng)體系可見，hUC-MSCs誘導Tr1產生依賴于可溶性細胞因子，transwell組與對照組Tr1百分比無明顯差異(11.07±0.85 vs.10.60±0.47，P＞0.05)(4)通過分選LAG3+/CD49b+檢測IL-10表達進一步堅定hUC-MSCs誘導的Tr1。結果表明，LAG3+/CD49b可作為Tr1鑒定與分選的標志。