微小RNA-122與脂肪性肝病發(fā)病關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　脂肪性肝病(FLD)俗稱脂肪肝，包括酒精性脂肪性肝病（ALD）和非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD），是指脂質(zhì)在肝臟組織內(nèi)沉積超過肝臟重量的5％，或光鏡下＞30%的肝細(xì)胞出現(xiàn)脂變的臨床綜合征。NAFLD的病理類型包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎（NASH）及肝硬化，后者可發(fā)展為肝癌[1]。近年隨著生活水平提高和飲食習(xí)慣改變，NAFLD的患病率不斷提高，我們在廣東省城鄉(xiāng)人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)脂肪肝患病率已達(dá)15%，接近發(fā)達(dá)國家20%-

2、30%水平[2，3]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，治療選擇有限。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一類長約21～22核苷酸的小分子非編碼RNA，是動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控因子，通過RNA干擾，降解或抑制靶mRNA的翻譯，調(diào)控蛋白編碼基因的表達(dá)，在細(xì)胞生長、分化和死亡等過程中起重要作用，其表達(dá)的失調(diào)會(huì)引起疾病。miRNAs與腫瘤的關(guān)系報(bào)告最多，而與代謝性疾病及 NAFLD關(guān)系的研究較為欠缺[4]。本文探

3、討肝細(xì)胞株miR-122表達(dá)水平與肝脂肪變的關(guān)系，并觀察轉(zhuǎn)染模擬物miR-122前體（pre-miR-122）和抑制物miR-122抗體（anti-miR-122），對脂肪變肝細(xì)胞miR-122表達(dá)和脂肪含量的影響，從分子水平探討NAFLD診斷的新標(biāo)記物和治療的新靶點(diǎn)。
　　目的：
　　探討肝細(xì)胞株脂肪變后miR-122表達(dá)水平的變化，觀察轉(zhuǎn)染pre- miR-122及anti-miR-122對脂肪變肝細(xì)胞的miR-122表

4、達(dá)和脂肪含量的影響。
　　方法：
　　1．用油酸誘導(dǎo)法建立肝細(xì)胞株（L-02）脂肪變模型。
　　2．制作正常肝細(xì)胞及油酸誘導(dǎo)24h、48h、72h的脂肪變細(xì)胞爬片：用親脂性熒光染料尼羅紅染色，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴情況。利用Olympus Fluview ver.3.0 viewer軟件分析細(xì)胞內(nèi)脂滴熒光強(qiáng)度。同時(shí)用甘油三酯試劑盒檢測正常肝細(xì)胞、油酸誘導(dǎo)24、48、72小時(shí)細(xì)胞株的甘油三酯含量。
　　3．

5、檢測miR-122表達(dá)：提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用熒光定量PCR檢測正常肝細(xì)胞及油酸誘導(dǎo)脂肪變細(xì)胞miR-122的表達(dá)。
　　4．轉(zhuǎn)染miR-122模擬物和抑制物：瞬時(shí)轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。除未轉(zhuǎn)染脂肪變細(xì)胞組外，設(shè)模擬物實(shí)驗(yàn)組（miR-122 mimic）、模擬物對照組（mimic C）、抑制物實(shí)驗(yàn)組（anti-miR-122）、抑制物對照組（inhibitor C）。分別用合成的pr

6、e-miR-122及其對照物、anti-miR-122及其對照物進(jìn)行轉(zhuǎn)染，干擾后6小時(shí)評價(jià)轉(zhuǎn)染效率，72小時(shí)檢測miR-122表達(dá)水平，同時(shí)觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)脂滴變化。
　　5．統(tǒng)計(jì)分析各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。滿足正態(tài)分布或經(jīng)轉(zhuǎn)換后滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分布不滿足正態(tài)時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05。
　　結(jié)果：
　　1．成功建立體外脂肪

7、肝細(xì)胞株模型：油酸誘導(dǎo)24h、48h、72h細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡結(jié)合Olympus Fluview ver.3.0 viewer軟件對脂滴進(jìn)行分析，顯示脂肪變肝細(xì)胞內(nèi)脂滴平均熒光強(qiáng)度顯著高于對照肝細(xì)胞（24h時(shí)860.01±26.52 vs257.77±29.69）（P<0.001），且隨著油酸誘導(dǎo)時(shí)間延長（24h、48h、72h），脂肪變肝細(xì)胞內(nèi)脂滴平均熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（P<0.05）。用甘油三酯試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)甘

8、油三酯含量顯示，脂肪變肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量較對照肝細(xì)胞顯著增加(24h時(shí)3.47±0.116 vs1.865±0.015)（P<0.01），并隨著油酸誘導(dǎo)時(shí)間延長（24h、48h、72h）而逐漸增加（P<0.05）。
　　2．脂肪變肝細(xì)胞 miR-122表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)拷貝數(shù)僅為正常肝細(xì)胞的1/21.74（P<0.05）。
　　3．脂肪變肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染對照物mimic C和inhibitor C后，兩對照組miR-122表達(dá)

9、和未轉(zhuǎn)染的脂肪變肝細(xì)胞比較差異不顯著（P>0.05）。而轉(zhuǎn)染miR-122 mimic后，脂肪變肝細(xì)胞miR-122的表達(dá)顯著增加，是未轉(zhuǎn)染的脂肪變細(xì)胞2.96倍（P<0.05），其細(xì)胞內(nèi)脂滴平均熒光強(qiáng)度（790.92±46.72）較未轉(zhuǎn)染脂肪變肝細(xì)胞（1022.16±49.66）顯著減少（P<0.05）；轉(zhuǎn)染 anti-miR-122后，脂肪變肝細(xì)胞miR-122的表達(dá)量顯著減少，是未轉(zhuǎn)染的脂肪變肝細(xì)胞1/3.45（P<0.05），其

10、細(xì)胞內(nèi)脂滴平均熒光強(qiáng)度（1386.49±403.44）較未轉(zhuǎn)染脂肪變肝細(xì)胞（1022.16±49.66）顯著增加（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．肝細(xì)胞脂肪變后miR-122表達(dá)顯著下降。
　　2．對脂肪變肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-122模擬物后細(xì)胞內(nèi)miR-122表達(dá)顯著增高，而脂含量顯著減少；轉(zhuǎn)染miR-122抑制物后細(xì)胞內(nèi)miR-122表達(dá)顯著降低，而脂含量顯著增加。
　　3．miR-122參與脂肪性肝病的發(fā)