補腎對凍存后自體移植小鼠卵巢功能影響的研究.pdf

1、目的：研究補腎對凍存后自體異位移植卵巢卵泡存活和卵泡發(fā)育的影響并探討其作用機制。
　　方法：本研究以腎主生殖理論為指導(dǎo)，將小鼠冷凍復(fù)蘇卵巢自體異位移植，異位移植小鼠隨機分為六組，分別為五子衍宗丸組（五子組）、左歸丸組（左歸組）、右歸丸組（右歸組）、PMSG組、模型組和正常組，并采取術(shù)前、術(shù)后和全程用藥3種不同給藥方式，以同期模型組為對照，移植后7、21和35天回收移植卵巢組織，采用組織學(xué)、免疫組化、體外成熟、體外受精和實時定量PC

2、R等方法對凍存后自體異位移植卵巢卵泡生長、卵母細(xì)胞發(fā)育和相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行研究。
　　結(jié)果：⑴本次實驗摘除卵巢再移植小鼠246只，摘除凍存移植卵巢492個。有效回收卵巢338個，凍存移植卵巢總有效回收率為68.70％。移植卵巢7d、21d和35d，各組卵巢回收率與模型組比較表明：五子衍宗丸顯著提高凍存卵巢自體異位移植后的存活率（p＜0.01）；移植前使用五子衍宗丸提高凍存后自體異位移植卵巢的存活率（p＜0.05）； PMSG提高凍存

3、卵巢自體異位移植后的存活率（p＜0.05）。卵巢自體異位移植第7天，各組凍存后自體異位移植卵巢都未觀察到竇狀卵泡和排卵前卵泡，移植第21天和第35天，自體異位移植卵巢觀察到原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡和竇狀卵泡等各級卵泡生長，五子衍宗丸組最顯著。自體異位移植卵巢組織經(jīng)VEGF免疫組化方法檢測，移植第七天，自體異位移植卵巢組織皮質(zhì)及其外周組織VEGF表達(dá)有不同程度的增加。移植21天和35天，在各級卵泡細(xì)胞和顆粒細(xì)胞之外的間質(zhì)細(xì)胞VEGF有

4、增強表達(dá)。TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測（FITC標(biāo)記）凍存后自體異位移植卵巢組織，7d組中，細(xì)胞凋亡陽性表達(dá)面積廣泛，21d和35d組中，隨著移植卵巢卵泡逐漸生長，凋亡陽性細(xì)胞的表達(dá)區(qū)間逐步縮小，間質(zhì)是凋亡陽性細(xì)胞的主要表達(dá)部位。卵巢移植后第21天，五子衍宗丸組血清雌二醇（3.26±0.17 ng/ml）水平最高，且與模型組、左歸組和右歸組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（p＜0.05），表明五子衍宗丸較左、右歸丸能夠更好的促進(jìn)自體異位移植卵巢組織卵泡發(fā)

5、育。⑵自體異位移植卵巢第21天和第35天，各組凍存后自體異位移植卵巢共回收卵母細(xì)胞64枚和69枚，僅五子衍宗丸組回收有GV期和MⅡ期卵母細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)與正常組回收卵母細(xì)胞一致。各組卵母細(xì)胞數(shù)量與模型組比較，表明五子衍宗丸、右歸丸和PMSG提高凍存卵巢自體異位移植后卵母細(xì)胞數(shù)量（p＜0.05）；隨給藥次數(shù)增加，五子衍宗丸和右歸丸促進(jìn)移植卵巢功能進(jìn)一步恢復(fù)，數(shù)量增加（p＜0.05）。本次實驗，五子衍宗丸組未成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后發(fā)育到MⅡ

6、期，成熟卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精，發(fā)育到2-細(xì)胞和桑葚胚階段。表明五子衍宗丸不僅提高凍存卵巢自體異位移植后卵母細(xì)胞數(shù)量，還可有效恢復(fù)凍存后自體異位移植卵巢卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。⑶凍存移植卵巢和正常卵巢均可檢測到目的基因GDF-9、AMH、FSHR、LHR、VEGF、Ang2、Bax、Bcl-2、fas和fasl mRNA的表達(dá)。通過檢測各組目的基因，與模型組比較，通過細(xì)胞凋亡Bcl-2/Bax通路和血管新生調(diào)節(jié)通路，五子衍宗丸改善早期凍存后自體