1株產堿性木聚糖酶菌株的篩選、產酶條件與酶學性質研究及其木聚糖酶基因的克隆表達.pdf

1、半纖維素是僅次于纖維素含量第二豐富的可利用自然資源，其主要成分是木聚糖(xylan)。木聚糖的來源不同，分枝程度不同，其主鏈和支鏈帶有多種不同的取代基團。由于木聚糖結構的復雜性，它的完全降解需要多種水解酶的參與共同作用完成。β-1，4-內切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能夠以內切方式作用木木聚糖主鏈產生不同長度的木寡糖和少量的木糖，因此它是木聚糖降解酶中最關鍵的酶。 本試驗采用剛果紅染色的方法篩選出一株耐堿性木聚糖酶高產菌株，

2、對其產酶條件及酶學性質進行研究，并通過基因克隆手段得到編碼木聚糖酶的基因，實現該基因在大腸桿菌中的高效表達，整個試驗分三部分進行。 1.根據水聚糖酶分解木聚糖底物生成的寡糖不能被剛果紅染色，從而在菌落周圍形成透明圈這一特性，對從武漢晨鳴紙廠采集的堿性紙漿進行生孢子處理，根據不同菌株所形成的透明圈的有無，決定需要復篩的菌株，經產酶基本培養(yǎng)基復篩后，篩選到一株堿性木聚糖酶高產菌株，對該菌株進行普通染色、革蘭氏染色、形態(tài)學特征和16S

3、rDNA序列分析，初步確定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus.Subtilis)，并且命名為BYG6-6。 2.對其生長條件和產酶條件研究結果表明，該菌適宜在pH7.0、溫度33℃下生長。為了給菌體提供有效的營養(yǎng)，對培養(yǎng)基中的氮源和碳源進行了優(yōu)化，結果表明，應用樺木木聚糖作為碳源、牛肉膏作為氮源的培養(yǎng)基，能夠使細菌很好的生長，并表現良好的產酶能力。 改變木聚糖酶和底物作用時的溫度和pH值，確定該酶的最適值及其耐受性。

4、結果顯示：該酶最適反應溫度為酶反應的最適溫度為55℃。在65℃時酶活仍有73.07％.證明該酶屬于嗜中溫酶類，不具有高溫耐受性；酶反應最適pH值為6.74，在pH為7.22時剩余木聚糖酶的活力為91.8％，即使反應pH值升高到9.0和10.0時，剩余酶活力仍在70％以上，說明該菌株所產酶具有較強的耐堿性。 3.根據已經報到的枯草芽胞桿菌木聚糖酶基因，設計特異性引物從BYG6-6基因組中擴增得到一個基因片段，連接到pGEM-T V

5、ector載體上測序得到該基因序列，經在線比對分析該基因與已報道的木聚糖酶基因的同源性達到99％以上。借助軟件分析表明：該基因全長642個堿基，基因序列為一個完整的閱瀆框，起始密碼為ATG，終止密碼TAG連續(xù)編碼214個氨基酸，分子大小約為24kDa。 我們利用引物B3-up和B3-down，從高產術聚糖酶的枯草芽孢桿菌BYG6-6中克隆木聚糖酶基因，接著將其構建在表達載體PET-28(a)中，用 Escherichia col