松材線蟲Bx-vaP-1基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及功能分析.pdf

1、松材線蟲病(Pine wilt disease)又稱松樹萎蔫病或松樹枯萎病，是松樹的一種毀滅性病害。目前已知分布于中國、日本、韓國、美國、加拿大、墨西哥、葡萄牙、西班牙等國家。我國自上世紀(jì)80年代初首次發(fā)現(xiàn)該病以來，病情擴(kuò)散蔓延迅速，已對我國的松林生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成了嚴(yán)重的破壞和威脅，成為我國最危險的森林有害生物之一。該病害的發(fā)生涉及寄主樹種、傳播媒介、松材線蟲及其攜帶的微生物、以及環(huán)境因素等多個方面，至今其致病機(jī)理尚存爭議。若要進(jìn)一步深入揭

2、示松材線蟲病的致病機(jī)理，最直接、最有效的方法就是獲取松材線蟲致病過程中的關(guān)鍵基因信息，并對其進(jìn)行功能分析。
　　目前國際上已公認(rèn)植物寄生線蟲食道腺細(xì)胞分泌物在植物線蟲與寄主互作過程早期起到關(guān)鍵作用，因此編碼這類分泌物的基因被認(rèn)為是線蟲的致病相關(guān)基因。其中，在食道腺細(xì)胞特異表達(dá)的類毒液過敏原蛋白基因（Bx-vap-1）已成功在松材線蟲中克隆分離，推測該基因在松材線蟲寄生寄主的早期階段發(fā)揮了重要作用，很可能是松材線蟲的致病基因。

3、>　　本研究即以Bx-vap-1基因為研究對象，采用正向驗證基因功能的方法，將Bx-vap-1基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)獲得重組VAP蛋白，用來模擬松材線蟲口腔分泌物，接種三年生馬尾松，檢測不同時期寄主松樹防御基因的表達(dá)、萜烯含量的變化以及組織病理學(xué)變化，意從分子防御水平、生理代謝水平和組織病理學(xué)水平上的寄主響應(yīng)事件來分析Bx-vap-1基因的功能，從而為松材線蟲病致病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)。主要結(jié)論如下:
　　1.利用Bac-to-Ba

4、c表達(dá)系統(tǒng)原理，將松材線蟲Bx-vap-1基因克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA，將重組質(zhì)粒pFastBac-vap轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)座，獲得重組桿狀病毒表達(dá)載體Bacmid-vap。在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，病毒擴(kuò)增3代后收獲重組VAP蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot檢測驗證了目的蛋白的特異性。通過對P2代桿狀病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的M.O.I值和轉(zhuǎn)染時間進(jìn)行優(yōu)化，最終實

5、現(xiàn)了目的蛋白的大量表達(dá)。
　　2.利用RACE技術(shù)分離克隆了馬尾松α-蒎烯合成酶基因全長，并結(jié)合生物信息學(xué)軟件分析了該基因編碼蛋白的特性。馬尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全長序列共1890bp，編碼629個氨基酸。編碼蛋白的預(yù)測分子量為71.94 kDa。α-蒎烯合成酶基因編碼蛋白含有1個金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個天冬氨酸富集基序(DDMYD)，符合單萜烯合成酶基因的典型特征。序列提交至GeneBank，獲得登錄號KF547035。該基

6、因的分離克隆為研究馬尾松分子防御機(jī)制提供了基因信息。
　　3.將重組VAP蛋白作為接種體，模擬松材線蟲口腔分泌物，接種三年生馬尾松，接種試驗表明重組VAP蛋白可以誘導(dǎo)馬尾松α-蒎烯合成酶基因上調(diào)表達(dá)和α-蒎烯含量增加，這表明在松材線蟲與松樹互作過程中，線蟲口腔分泌的VAP蛋白可作為激發(fā)子啟動寄主的防御反應(yīng)，因此編碼VAP蛋白的Bx-vap-1基因是松材線蟲的致病基因。
　　4.重組VAP蛋白接種三年生馬尾松，接種點(diǎn)附近表現(xiàn)出