血根堿引起的藥物—藥物相互作用及抗惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、背景:血根堿是一種具有抗微生物、抗炎等多種生物學(xué)活性的生物堿，因其對多種人類腫瘤細(xì)胞系有較強(qiáng)的抑制作用而被推薦為抗癌候選藥物。鑒于對中藥單體的毒性和藥效活性評價(jià)是其成藥的兩大前提因素，因此本研究擬對血根堿的毒性和抗癌活性進(jìn)行深入的探討。藥物的毒副作用已經(jīng)被大量文獻(xiàn)報(bào)道，其產(chǎn)生毒性存在種屬差異。血根堿對細(xì)胞色素P450酶的抑制與其毒性相關(guān)。惡性黑素瘤是高度惡性皮膚腫瘤，可發(fā)生早期血行轉(zhuǎn)移，腦和肺等是其主要侵襲、轉(zhuǎn)移器官，該類疾病手術(shù)治療困

2、難，且預(yù)后極差。惡性黑素瘤惡性程度高、轉(zhuǎn)移發(fā)生早。理想的抗惡性黑素瘤的藥物最好既能有效的抑制原發(fā)腫瘤的增殖，又能抑制其轉(zhuǎn)移。目前用于抗腫瘤藥物篩選的體外模型主要是平面培養(yǎng)，即二維模型。細(xì)胞二維培養(yǎng)模型存在一些缺陷:缺乏真實(shí)的腫瘤組織的微環(huán)境，缺少細(xì)胞外基質(zhì)的支持，腫瘤細(xì)胞的貼壁生長使其喪失了某些生物學(xué)特性。
　　目的:
　　1.研究血根堿是否會(huì)誘發(fā)經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用。
　　2.研究血根堿是否能夠抑制人惡

3、性黑色素瘤細(xì)胞株451LU的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
　　3.建立一種人惡性黑色素瘤細(xì)胞株451LU的三維培養(yǎng)模型，對其形態(tài)學(xué)及功能學(xué)進(jìn)行初步評價(jià)，并在此基礎(chǔ)上對血根堿的抗腫瘤活性再次進(jìn)行評價(jià)。
　　方法:
　　1.通過CYP探針底物反應(yīng)，對血根堿對CYP酶各個(gè)亞型的抑制能力進(jìn)行評價(jià)，繼而通過單點(diǎn)失活實(shí)驗(yàn)、抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行可逆和基于時(shí)間依賴的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定，根據(jù)FDA推薦的預(yù)測公式推導(dǎo)出體內(nèi)血根堿藥物-藥物相互作用

4、程度的預(yù)測。
　　2.用SRB法檢測不同濃度血根堿對惡性黑素瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響，通過Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測目標(biāo)濃度血根堿對惡性黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。通過transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)-細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來檢測血根堿對惡性黑色素瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、粘附及對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。通過realtimePCR，Westernblot來檢測腫瘤轉(zhuǎn)移、粘附、血管生成相關(guān)基因和

5、蛋白的影響。WesternBlot法檢測血根堿對惡性黑索瘤細(xì)胞的FAK信號通路的影響。
　　3.將人惡性黑色素瘤細(xì)胞株451LU種植于鼠尾膠原中，使細(xì)胞在三維立體條件下生長。通過組織學(xué)染色、細(xì)胞活性分析及免疫熒光染色對細(xì)胞的形態(tài)學(xué)進(jìn)行評價(jià)，通過DNA含量的測定來反映不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖的情況，通過realtimePCR檢測相關(guān)基因表達(dá)量的差異。通過MTT法評價(jià)四種抗癌藥物對惡性黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響。
　　結(jié)果:

6、>　　1.對血根堿是否會(huì)引經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用進(jìn)行研究
　　首先考察80μM血根堿對CYP各個(gè)亞型催化的探針反應(yīng)的抑制作用，結(jié)果顯示對于CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4，血根堿對其活性的抑制超過50％，進(jìn)一步對其抑制的半數(shù)抑制濃度(IC50)進(jìn)行測定。血根堿對其催化的反應(yīng)產(chǎn)生濃度依賴型的抑制，IC50值分別為4.5、10.2、7.2和3.4μM。選擇不同血根堿濃度和探針底物濃度對抑制CYP1A2

7、，CYP2C8，CYP2C9，CYP34的可逆抑制類型和抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了測定。用Lineweaver-Burk作圖方法來判斷可逆抑制類型，用二次作圖來計(jì)算抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，血根堿對CYP1A2，CYP3A4和CYP2C9的抑制類型屬于競爭性抑制，而對CYP2C8屬于非競爭性抑制。用Lineweaver-Burk作圖中的每條線的斜率對血根堿濃度作圖，求得可逆抑制常數(shù)Ki，CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4K

8、i值分別為2.7、8.9、3.8和2.0μM。在單點(diǎn)失活實(shí)驗(yàn)中，加入NADPH預(yù)孵后的血根堿對CYP1A2、CYP3A4活性的抑制百分比分別增加了25.5％和20.3％，對其它CYP亞型的抑制增加的百分比均小于15％。研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對CYP1A2，CYP3A4催化的反應(yīng)體現(xiàn)出時(shí)間依賴和NADPH依賴的抑制行為。其對兩酶的TDI抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)K(l)/kinactvalues分別為13.3/0.087和5.58/0.029min-1μM

9、-1.
　　2.研究血根堿是否能夠抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞株451LU的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力
　　0.02-50μM血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451-LU細(xì)胞的細(xì)胞活力，為避免細(xì)胞活力因素對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，分別選擇安全濃度、低毒濃度和80％細(xì)胞活力的三個(gè)濃度，即1μM、1.5μM、2μM三個(gè)濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。AnnexinⅤ和PI雙染流式細(xì)胞術(shù)可見1-2μM血根堿對451-LU細(xì)胞活力無明顯的影響。1-2μM血根堿對451

10、-LU細(xì)胞粘附能力均有一定的抑制作用?？梢砸种?51-LU細(xì)胞與基質(zhì)膠原的粘附作用，且抑制能力呈時(shí)間、濃度依賴性。血根堿可以抑制451-LU細(xì)胞侵襲、遷移的能力，但各組間未見顯著差異。通過SRB方法檢測血根堿對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，nM級別的血根堿可對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用。分別選取與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的三組蛋白，MMP-2、MMP-2、ICAM-1、VCAM-1、EGF和VEGF-A，將原位惡性黑素瘤WM35

11、與轉(zhuǎn)移株451LU細(xì)胞中各蛋白mRNA的表達(dá)情況通過realtime-PCR的手段進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A的mRNA表達(dá)存存顯著的增加。1-2μM血根堿均可以抑制ICAM-1，MMP-2，EGF和VEGF-A的mRNA表達(dá)。血根堿同樣可以抑制ICAM-1，MMP-2蛋白的表達(dá)，可以下調(diào)FAK及P-FAK的表達(dá)。
　　3.人惡性黑素瘤細(xì)胞株451LU三維培養(yǎng)模型
　　傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)中，3

12、天左右細(xì)胞出現(xiàn)增殖，5天左右開始出現(xiàn)凋亡，到第7天已經(jīng)大部分凋亡，而三維培養(yǎng)條件下，451LU細(xì)胞呈腫瘤團(tuán)狀增殖，至14天仍可見良好細(xì)胞活性。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖能力顯著增加。顯微鏡下可見細(xì)胞呈球團(tuán)狀生長，晚期（14天）腫瘤團(tuán)中央可出現(xiàn)缺氧壞死，與在體腫瘤類似。使用MTT的方法對二維培養(yǎng)條件和三維培養(yǎng)條件下阿霉素、長春堿、紫杉醇和血根堿的抗451LU活性進(jìn)行檢測，在三維培養(yǎng)條件下，阿霉索、長春堿和血根堿各組的I

13、C50值存在不同程度的提升，而紫杉醇組仍舊未檢測到抗癌活性。在三維培養(yǎng)條件下，分別選取在二維培養(yǎng)條件下出現(xiàn)顯著差異的ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A，及其在惡性黑素瘤中存在高表達(dá)的WT1、BRAF-V600E，與藥物吸收相關(guān)的P-gp，與腫瘤細(xì)胞脫落相關(guān)的KLK7，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在三維培養(yǎng)條件下，MMP2、ICAM-1、BRAF-V600E、p-gp的mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著的增加。
　　結(jié)論:
　　1.血根堿對C

14、YP1A2、CYP3A4和CYP2C9產(chǎn)生了競爭性的可逆抑制作用，對CYP2C8產(chǎn)生了非競爭性的可逆抑制作用。血根堿還對CYP1A2和CYP3A4產(chǎn)生了時(shí)間依賴性的抑制。血根堿與CYP1A2、CYP3A4、CYP2C8和CYP2C9的底物共用時(shí)可能誘發(fā)嚴(yán)重藥物-藥物相互作用。
　　2.血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451LU細(xì)胞增殖能力。同時(shí)，血根堿可抑制黑素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成的能力，其抑制侵襲轉(zhuǎn)移的能力可能與下調(diào)MMP2、I