結核分枝桿菌抗原特異性體液免疫應答的篩查及其臨床意義初探.pdf

1、結核?。╰uberculosis，TB）主要是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tb）感染引起的傳染性疾病，病原菌主要通過空氣經呼吸道傳播。結核病是目前僅次于AIDS的第二大傳染病殺手，2012年數據統(tǒng)計結果顯示全球新發(fā)結核病患者達870萬之多，死于結核病人數達140萬；中國是全世界結核病高負擔的國家之一，2011年新增結核病人數達90~110萬，僅次于印度位居世界第二[1]。因此，結核病的國內

2、外防控形勢非常嚴峻。
　　為更有效地控制結核病的傳播以及降低其發(fā)病率和致死率,我們不僅需要具有免疫保護作用的疫苗，及時準確的診斷技術和優(yōu)化的治療方案也是結核病防控的重要環(huán)節(jié)。然而，目前上述三個方面都存在缺陷和發(fā)展瓶頸：BCG疫苗是目前唯一批準使用的結核病預防性疫苗，其使用已經超過一百年，雖然至今仍在使用，但其只對兒童起保護作用，而無法控制結核病在成年人之間的傳播，保護效果存在很大局限性；當前結核病的治療藥物基本是在上世紀初發(fā)展起來

3、的抗菌藥物，特異性差，治療時間長，且副作用大，并隨著耐藥結核的出現，藥物治療效果日益受到挑戰(zhàn)；結核病是目前臨床上診斷最為復雜的疾病之一,現有臨床診斷技術在準確性和及時性上仍顯不足，痰涂片抗酸染色法(sputum smear microscopy)只有在患者痰液中 M.tb含量很高的時候才能檢測為陽性，因此很容易出現假陰性；痰結核菌培養(yǎng)法（sputum culture test）能提供更高的準確性，但此法周期長（三周至兩個月），可能延誤治

4、療；基于遲發(fā)型超敏反應的PPD皮試試驗則由于受檢者接種過BCG而出現假陽性，也很難區(qū)分潛伏感染和活動期結核病。因此，結核病在預防、診斷和治療方面都需得到進一步提高。
　　抗M.tb感染免疫應答中，細胞免疫應答發(fā)揮關鍵作用，而體液免疫應答的作用則存在爭議。然而越來越多的證據表明，體液免疫應答在抗M.tb感染中具有重要作用。探討M.tb感染引起的抗原特異性體液免疫應答格局不僅能為體液免疫應答在抗 M.tb感染中的作用提供證據，還將為新

5、疫苗的開發(fā)、新型診斷標志物的篩選以及生物免疫治療方案等研究提供新的候選分子。
　　本研究中，我們利用生物信息學分析等方法，篩選和獲得多個膜型或是分泌型結核分枝桿菌病原蛋白，通過原核系統(tǒng)表達并純化其中39個M.tb蛋白質抗原，通過間接ELISA試驗比較檢測了活動期結核病患者與健康人群對照組血漿中抗原特異性IgG、IgM和IgA的水平。39個抗原特異性IgG水平的檢測結果顯示，活動期結核病患者體內的抗原特異性 IgG水平普遍高于健康對

6、照組，其中28個抗原的IgG水平升高存在顯著性差異；對22個抗原特異性IgA水平檢測結果顯示，其中20個抗原特異性IgA水平在活動期結核病患者與健康對照組相比，存在顯著性升高；對10個抗原的特異性IgM水平檢測結果顯示，活動期結核病患者的抗原特異性IgM水平普遍則低于健康對照組，其中7個抗原的IgM水平在患者中減低具有顯著性差異。上述結果表明，活動期結核病患者中代表初次免疫應答的病原菌抗原特異性IgM水平明顯低于正常對照，而再次應答產生

7、的特異性IgG和IgA的水平在兩組人群中比例則表現為患者高于正常人，由此反映出活動期結核病患者中產生的結核分枝桿菌特異性免疫應答和再次免疫應答相關聯(lián)，這可能與這些活動期患者的結核分枝桿菌持續(xù)感染密切相關。對存在顯著性差異的結核分枝桿菌抗原特異性的IgG和IgA水平進行ROC分析，結果顯示Rv0440（HSP65）和Rv3841的IgG檢測靈敏度達90％，特異性達90%，ROC曲線的AUC值分別達0.965和0.966，上述指標均與目前臨

8、床上使用的抗38KD（Rv0934）蛋白的IgG水平相當；部分抗38KD IgG抗體陰性的結核病患者中抗HSP65 IgG抗體水平呈現陽性，提示抗HSP65 IgG可以成為目前商業(yè)化抗38KDIgG檢測的補充，從而進一步提高結核病診斷的靈敏度。
　　我們進一步結合活動期結核病患者的臨床資料初步分析了患者的體液免疫應答與臨床表現的關系，比較分析發(fā)現，空洞陽性患者抗Rv0440的IgG水平，抗Rv1837c、Rv1860、Rv0733

9、和 Rv3841的 IgA水平顯著高于空洞陰性患者；抗酸染色陽性患者抗 Rv2626c、Rv1980c、Rv3875和Rv3841的IgM水平顯著高于抗酸染色陰性患者。
　　我們同時還比較活動期結核病人對上述部分結合分枝桿菌抗原的體液免疫應答與細胞免疫應答間的相關性，從而為深入了解體液免疫應答與細胞免疫協(xié)同參與抗 M.tb感染的作用方式。為此，我們利用實驗室已經獲得的特異性抗原刺激下的IFNγ-ELISPOT試驗數據代表抗原特異性

10、T細胞免疫應答，分析結核病患者對同一抗原的抗體水平和釋放IFNγ的T細胞頻率之間的關聯(lián)，結果顯示特異性 IgG抗體水平與同一抗原刺激下的分泌 IFNγ的 T細胞頻率間呈負相關性、無相關性或正相關性的抗原分別占1/3左右，而大部分抗原的IgA水平與T細胞應答水平則呈現一定的負相關性。由于IgA是黏膜局部免疫應答產生的主要抗體分子，并進一步分布于外周，部分病原特異性IgA水平在患者外周的顯著升高一方面提示與感染局部免疫應答升高有關，其與外周