衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活氯電流的分子基礎(chǔ)及其激活機(jī)制研究.pdf

1、作為外周神經(jīng)節(jié)中一種重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(satelliteglial cells，SGCs)越來越多的受到人們的關(guān)注，它不僅可以為神經(jīng)元提供營養(yǎng)及結(jié)構(gòu)的支持，近來人們還發(fā)現(xiàn)它們參與了與神經(jīng)元之間的信息交流，對神經(jīng)元的興奮性產(chǎn)生了影響。因此，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元生理和病理狀態(tài)的影響成為了研究者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。在神經(jīng)元與衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的信息交流中，容量激活的氯通道可能發(fā)揮著很重要的作用，因?yàn)槿萘考せ盥韧ǖ赖拈_放可能影響著神經(jīng)元和

2、膠質(zhì)細(xì)胞間谷氨酸的釋放，進(jìn)而影響了神經(jīng)元的興奮性，這一神經(jīng)活動(dòng)與疼痛的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。
　　容量激活的氯電流(volume-acticated chloride currents，Iclswell)屬于氯通道電流的一種。氯離子通道是體內(nèi)最重要的陰離子通道，廣泛分布于各種組織，參與機(jī)體各種病理和生理過程，包括心率的形成、細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞體積的調(diào)控以及細(xì)胞凋亡等。但是人們對其分子結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識(shí)還相對較少。

3、對神經(jīng)系統(tǒng)容量激活氯通道的全面認(rèn)識(shí)有利于我們發(fā)現(xiàn)一些疾病包括疼痛的基本病理過程，為進(jìn)一步的治療提供可靠靶點(diǎn)。
　　第一部分、衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活氯電流的表達(dá)及分子基礎(chǔ)研究
　　目的:了解大鼠背跟神經(jīng)節(jié)(DRG)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上是否存在容量激活氯電流，及其分子基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠DRG衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活氯電流;
　　(2)螯合細(xì)胞內(nèi)鈣離子，阻斷細(xì)胞膜嘌呤受體等方法探明容量

4、激活氯電流的激活機(jī)制;
　　(3)慢病毒siRNA特異性敲除衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上的TMEM16A分子，研究容量激活氯電流與TMEM16A表達(dá)的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.大鼠背根神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)容量激活的氯離子電流。
　　全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高滲電極內(nèi)液條件下，在holding電壓為-60mV下，在大鼠DRG衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞可以觀察到一內(nèi)向電流。100μM鞣酸（Tannic acid，TA，氯離子通道阻斷劑）

5、可以阻斷該電流。當(dāng)將高滲細(xì)胞內(nèi)液CsCl2中的Cl-用SO42-代替后，高滲內(nèi)液誘導(dǎo)的內(nèi)向電流消失。
　　2.衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活的氯離子電流的激活與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放有關(guān)。
　　將高滲細(xì)胞內(nèi)液中的低濃度EGTA分別用高濃度的BAPTA和高濃度的EGTA替代時(shí)，在膜片鉗下記錄，當(dāng)電壓holding在-60mV時(shí)，隨著細(xì)胞體積不斷增加而出現(xiàn)的內(nèi)向電流分別下降了96.9％±2.5％(P＜0.01，n=9)和80.8％±17.2

6、％(P＜0.01,n=8)。
　　3.容量激活氯離子電流的激活與ATP受體激活有關(guān)在衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上，待容量激活的氯電流穩(wěn)定后，給予100μM的蘇拉明（suramin，P2受體阻斷劑）后電流與給藥之前相比下降了34.8％±2.0％(P＜0.01，n=5)。
　　4.衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活的氯電流的分子基礎(chǔ)可能是TMEM16A接下來我們用siRNA慢病毒特異性地敲除衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上的TMEM16A，再用上述的高滲內(nèi)液在膜片鉗下記錄

7、容量激活的氯電流，與對照組相比，轉(zhuǎn)染TMEM16A siRNA的膠質(zhì)細(xì)胞的容量激活的氯電流下降了79.6％±10％(P＜0.01，n=8)。
　　結(jié)論:通過膜片鉗實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大鼠DRG衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上存在容積激活的氯電流，其激活可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放有關(guān)。這種容量依賴的氯電流的分子基礎(chǔ)可能是TMEM16A。
　　第二部分、背根神經(jīng)節(jié)中磷脂酶C的表達(dá)
　　目的:研究在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中磷脂酶C(Phospholipase C

8、，PLC)的表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究磷脂酶C是否參與了容量激活氯電流的激活過程奠定基礎(chǔ)。
　　方法:RT-PCR; western blotting;免疫熒光。
　　結(jié)果:
　　1.PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中，四種PLC-β亞型的mRNA表達(dá)水平，以PLC-β3的表達(dá)水平最高，PLC-β4和PLC-β1次之，PLC-β2的基因表達(dá)水平最低。
　　2.免疫熒光結(jié)果在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中，PLC-β3、