多肽介導的納米遞釋系統(tǒng)靶向治療腦膠質瘤研究.pdf

1、神經膠質瘤占腦部腫瘤發(fā)病數的40％左右，是顱內最常見的惡性腫瘤。臨床上傳統(tǒng)治療方法為手術切除，但因為腦腫瘤部位接近患者的中樞神經，手術難以完全清除而易導致腫瘤復發(fā)?；熓悄X膠質瘤諸多治療環(huán)節(jié)中至關重要的一環(huán)，其成敗直接影響病人的生活質量和預后。然而，由于血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)和血瘤屏障(blood-brain tumor barrier, BTB)的存在限制了藥物向膠質瘤內部的遞送，同時藥物較弱的滲透

2、能力和入胞效率使腫瘤細胞內藥物濃度過低，導致目前臨床化療效果極其不理想。因此有效地增加膠質瘤組織中抗腫瘤藥物的濃度，并提高藥物的細胞內化是提高化療藥物療效的關鍵。
　　針對于此，本課題設計和構建了兩種新型的納米遞釋系統(tǒng):(1)以可活化（觸發(fā)式）低分子量魚精蛋白（activatable low-molecular-weight protamine，ALMWP）為靶向配體的腫瘤微環(huán)境酶響應型藥物遞送系統(tǒng)，以期解決吸附介導的膠質瘤靶向遞

3、藥系統(tǒng)缺乏細胞選擇性問題;(2)以MT1-AF7p肽修飾聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒聯合腫瘤穿透肽iRGD共同注射構建的共給藥納米遞藥系統(tǒng)，以期解決受體介導的膠質瘤靶向遞藥研究中靶向效率低的問題。通過兩種不同的策略來探索具有高度膠質瘤血管穿透和腫瘤滲透能力的納米遞藥系統(tǒng)，用于提高膠質瘤的治療效果。
　　本文第一部分構建了以可活化（觸發(fā)式）低分子量魚精蛋白(activatablelow-molecular-weight

4、protamine，ALMWP)為靶向配體的腫瘤微環(huán)境酶響應型藥物遞送系統(tǒng)。低分子量魚精蛋白(low molecular weight protamine，LMWP)是一種具有廣闊應用前景的細胞穿膜肽，具有與人免疫缺陷病毒(HIV)的轉錄活化因子Tat蛋白相似的穿膜性質，能介導遞釋系統(tǒng)高效入胞，但是其靶向性差，幾乎對所用細胞都有作用。在本研究中我們結合了在膠質瘤的血管內皮細胞及腫瘤細胞均高表達的基質金屬蛋白酶（matrix metall

5、oproteinase，MMP）MMP-2和MMP-9，以及穿膜肽LMWP能介導納米遞釋系統(tǒng)高效入胞的特點，設計了一種新型的可活化穿膜肽ALMWP。ALMWP包括三部分:一為穿膜肽低分子量魚精蛋白（low molecular weight protamine，LMWP）部分，其帶正電荷并具有強大的穿膜能力和運載潛能:二為負電性的陰離子肽段部分，能中和穿膜肽的正電荷;三為連接部分，選擇能被MMP-2/9高效切割的基質肽PLGLAG作為連接

6、肽段。在本研究中，我們采用將ALMWP修飾到包載紫杉醇(Paclitaxel，PTX)的聚乙二醇聚-己內酯(PEG-PCL)納米粒表面(ALMWP-NP-PTX)用于腦膠質瘤的靶向治療研究，該系統(tǒng)具有以下特性:(1) ALMWP在未被切割之前整體電荷保持中性，將其修飾到納米遞釋系統(tǒng)上不會改變其電位，體內給予后仍然保持納米粒的長循環(huán)性質;(2)納米粒到達腫瘤部位后，由于腫瘤部位高度表達金屬基質蛋白酶，能高效切割PLGLAG序列而使陰離子部

7、分解離，陽離子部分暴露而發(fā)揮強大穿膜作用，從而使納米粒大量被腫瘤細胞所攝取。
　　這部分的研究中，首先通過開環(huán)聚合法合成納米材料聚乙二醇聚己內酯(MPEG-PCL)和馬來酰亞胺聚乙二醇聚己內酯(Maleimide-PEG-PCL)并采用乳化溶媒蒸發(fā)法制備包載PTX的納米粒(NP-PTX)，利用馬來酰亞胺基特異性反應構建ALMWP修飾的載紫杉醇納米粒(ALMWP-NP-PTX)。制得的ALMWP-NP-PTX大小均勻，形態(tài)圓整，平均

8、粒徑為121 nm，Zeta電位為-21.8mV。細胞攝取結果顯示，與普通納米粒相比，ALMWP修飾的靶向納米粒顯著增加了C6膠質瘤細胞的攝取，并且其攝取過程是MMP-2/9依賴的，可被MMP抑制劑metastat抑制。C6腫瘤球滲透實驗結果也表明ALMWP-NP可顯著增強納米粒對實體腫瘤的滲透能力。攝取抑制實驗結果表明ALMWP-NP的內吞需要能量，通過巨胞飲和脂筏介導的兩種內吞途徑入胞，并且內吞過程有高爾基體和酸性溶酶體參與。藥動學

9、結果顯示ALMWP-NP-PTX組的AUC是LMWP-NP-PTX組的4.7倍(p＜0.001)，清除率(CL)相對于LMWP-NP-PTX組顯著降低(p＜0.001)。與LMWP-NP-PTX相比，ALMWP-NP-PTX的體內藥動學行為得到明顯改善;LMWP-NP-PTX由于其較強的正電荷而使其的非特異性攝取增加，血漿中的滯留時間顯著變短，而ALMWP-NP-PTX與NP-PTX的體內長循環(huán)效果相當，各藥動學參數無顯著性差別。荷C6

10、異位皮下瘤裸鼠的組織分布結果表明，ALMWP-NP顯著的增加了PTX在腫瘤部位的蓄積，其在各時間點腫瘤組織中PTX濃度分別為Taxol組濃度的2.31，3.73，2.90，2.20，2.77，2.86倍;NP組的2.02，2.49，2.40，1.79，2.49，2.74倍;LMWP-NP組的1.65，1.90，2.18，2.28，3.07，3.21倍。ALMWP-NP組在顯著增加腫瘤部位藥物濃度的同時，在非靶器官的蓄積和NP組無顯著性差

11、異。荷原位C6腦膠質瘤的裸鼠活體成像結果證明，在納米粒表面修飾ALMWP可明顯增加其在體內膠質瘤中的蓄積。荷原位瘤腦組織的冰凍切片實驗結果顯示在納米粒表面修飾ALMWP可明顯增加其在體內腦膠質瘤部位的蓄積和滲透。細胞毒結果顯示，ALMWP修飾的納米粒顯著增大了PTX對膠質瘤細胞的毒性作用。荷C6原位瘤小鼠的藥效學結果顯示，ALMWP-NP-PTX組的平均生存時間為48天，顯著高于生理鹽水組（20.5天）(p＜0.01，log-rank

12、analysis)，Taxol組（24天）(p＜0.01)，NP-PTX組（30天）(p＜0.01)和LMWP-NP-PTX組（34.5天）(p＜0.05)。
　　本文第二部分以MT1-AF7p肽修飾聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒聯合腫瘤穿透肽iRGD構建共給藥納米遞釋系統(tǒng)。膜型基質金屬蛋白酶-1（membrane type1-matrix metalloproteinase，MT1-MMP）在膠質瘤的血管生成和侵襲等過

13、程中發(fā)揮重要作用。MT1-MMP在腦膠質瘤細胞和新生血管內皮細胞上均高表達，其表達量隨腦膠質瘤惡性程度增加而增加，因此可作為臨床預后判斷的依據和臨床治療的靶點。MT1-AF7p肽是通過噬菌體展示技術篩選出來的含13個氨基酸的短肽，對MT1-MMP具有特異的親和性。本研究將MT1-AF7p肽修飾在包載PTX的聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)納米粒表面(MT1-NP-PTX)，通過膠質瘤細胞和腫瘤新生血管內皮細胞上均高表達的MT1-MMP

14、介導增加納米粒的膠質瘤主動靶向能力。iRGD肽（CRGDK/RGPDC）通過與腫瘤血管內皮特殊表達的αv整合素相結合從而定位于腫瘤，隨后在腫瘤中分裂成CRGDK/R，進一步結合神經纖毛蛋白Neuropilin-1(NRP-1)。CRGDK/R與NRP-1的結合調控著一種激活的運輸系統(tǒng)，讓同時注射的藥物從血管中滲出，從而調節(jié)藥物的一種特殊的腫瘤組織滲透性。為了提高遞藥系統(tǒng)的膠質瘤靶向效率，本研究將MT1-AF7p肽修飾的PEG-PLA納米

15、粒聯合iRGD肽共同注射構建共給藥系統(tǒng)，以克服BTB的阻礙作用，進一步增加納米粒透過膠質瘤血管的能力和在腫瘤部位的蓄積。
　　采用乳化溶媒蒸發(fā)法制備包載PTX的PEG-PLA納米粒(NP-PTX)，并通過納米粒表面的馬來酰亞胺基團將MT1-AF7p共價結合到納米粒表面。制備的MT1-NP-PTX粒徑在131 nm左右，Zeta電位-31.43 mV，納米粒表面MT1-AF7p肽的連接數目為317。C6細胞攝取的定性結果顯示，其對M

16、T1-NP的攝取顯著高于NP。細胞攝取的定量結果顯示，C6細胞對MT1-NP的攝取呈現時間、濃度和溫度依賴性，說明其對MT1-NP的攝取是一個主動轉運過程。攝取抑制實驗結果表明MT1-NP的內吞需要能量，主要通過巨胞飲和脂筏介導的兩種內吞途徑入胞，并且內吞過程有高爾基體參與。通過C6細胞毒和細胞凋亡等實驗表明MT1-AF7p肽修飾的納米粒顯著增大了PTX對膠質瘤細胞的抑制作用。體外C6細胞三維腫瘤球模型評價結果表明MT1-AF7p肽的修

17、飾顯著增強了納米粒對實體腫瘤的滲透能力和抑制能力。通過荷C6原位瘤小鼠的體內實驗評價共給藥系統(tǒng)的膠質瘤體內靶向性。小動物活體成像和腦組織的冰凍切片結果顯示，MT1-AF7p肽的修飾和iRGD肽的共給藥顯著提高了納米粒穿過腫瘤血管的能力和在膠質瘤部位的蓄積。原位膠質瘤裸鼠的生存時間考察結果顯示，共給藥組(MT1-NP-PTX+ iRGD)的平均生存時間為60天，顯著高于Saline組（21天）(p＜0.001,log-rank analy