SmDXS2基因遺傳轉(zhuǎn)化丹參毛狀根對(duì)其丹參酮含量的影響.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)作為一種傳統(tǒng)中藥主要應(yīng)用于臨床對(duì)心血管系統(tǒng)疾病的治療。丹參酮作為其主要有效成分之一具有消炎、抑菌、抗氧化及抗癌等多種生物活性。然而由于丹參野生資源日益減少,栽培丹參生長(zhǎng)周期較長(zhǎng),品質(zhì)嚴(yán)重退化,藥用活性成分含量低遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)要求等問(wèn)題,使得如何使丹參這一原料藥材的供應(yīng)在數(shù)量和質(zhì)量上能更好地滿足臨床應(yīng)用的需求成了一個(gè)研究熱點(diǎn)。
　　 本課題采用基因工程手段,從分子水平上對(duì)丹

2、參酮生物合成途徑進(jìn)行改造,首次將關(guān)鍵酶基因SmDXS2遺傳轉(zhuǎn)化丹參,利用構(gòu)建1-脫氧-D-木酮糖-5磷酸(DXP)途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶-1-脫氧-D-木酮糖合成酶(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase,DXS)基因的一個(gè)成員SmDXS2的過(guò)量表達(dá)載體(pCAMBIA1304++SmDXS2)以及抑制表達(dá)載體(pCAMBIA1304++Anti-SmDXS2),通過(guò)農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化丹參,將

3、SmDXS2和Anti-SmDXS2基因轉(zhuǎn)入丹參,并獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根。進(jìn)而分析SmDXS2在陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因毛狀根株系中的表達(dá)變化情況,同時(shí)測(cè)定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因毛狀根株系的丹參酮含量,從而研究關(guān)鍵酶基因SmDXS2在丹參酮合成代謝通路中所發(fā)揮的作用。所取得的結(jié)果如下:
　　 1.載體構(gòu)建和工程菌制備:在本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)之上,成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1304++SmDXS2和pCAMBIA1304++Anti-SmDXS2。用

4、凍融法將兩個(gè)表達(dá)載體質(zhì)粒分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1中,PCR檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明成功獲得了用于遺傳轉(zhuǎn)化的C58C1工程菌；
　　 2.丹參遺傳轉(zhuǎn)化:用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化丹參葉片,結(jié)果分別獲得SmDXS2陽(yáng)性毛狀根克隆46個(gè)和Anti-SmDXS2陽(yáng)性克隆34個(gè)；
　　 3.基因整合:PCR檢測(cè)中,分別在植物表達(dá)載體上組成型啟動(dòng)子CaMV35S的內(nèi)部及插入基因的內(nèi)部設(shè)計(jì)上游及下游特

5、異性引物進(jìn)行DNA的PCR擴(kuò)增,結(jié)果證實(shí)獲得18個(gè)SmDXS2陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性率為39.1％,14個(gè)Anti-SmDXS2陽(yáng)性克隆,陽(yáng)性率為41.2％；
　　 4.轉(zhuǎn)錄水平表達(dá):半定量RT-PCR結(jié)果顯示,SmDXS2在不同克隆中的表達(dá)水平不同,且SmDXS2陽(yáng)性克隆的表達(dá)量明顯高于Anti-SmDXS2陽(yáng)性克隆；
　　 5.丹參酮含量:利用HPLC測(cè)定丹參轉(zhuǎn)基因毛狀根中丹參酮含量,結(jié)果表明,過(guò)量表達(dá)SmDXS2的克隆中丹