H2S和NO促進匍枝筋骨草20E積累的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、匍枝筋骨草（Ajuga lobata）是一種富含甾酮和生物堿等多種活性物質(zhì)的藥用植物。目前，對筋骨草屬植物中蛻皮激素類似物的應用主要集中在昆蟲生長調(diào)節(jié)劑與醫(yī)藥保健領域的研發(fā)方面，可見來源于筋骨草屬植物中的蛻皮激素類似物已倍受研究者的關注。但到目前為止，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)植物蛻皮激素的瓶頸問題依然存在。近年來的研究主要集中在蛻皮激素的提取與分析方法、蛻皮激素源植物的篩選及新蛻皮激素類似物的鑒定方面，而關于其基因和蛋白水平的研究卻鮮有報道。本

2、文以產(chǎn)β-蛻皮甾酮的愈傷組織為材料進行細胞懸浮培養(yǎng)，分析了H2S、NO對β-蛻皮甾酮積累的調(diào)控作用;然后以H2S、NO兩種信號分子誘導的匍枝筋骨草懸浮細胞為材料，利用Illumina技術進行了轉(zhuǎn)錄組測序，并對H2S、NO、Control樣品分別進行了數(shù)字基因表達譜分析;最后運用轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學技術，從差異表達基因和差異蛋白層面探討了H2S、NO誘導后匍枝筋骨草細胞的分子應答情況。主要研究結果如下:
　　1、利用細胞懸浮培養(yǎng)技術

3、對H2S和NO誘導的匍枝筋骨草高產(chǎn)β-蛻皮甾酮細胞系進行了篩選，結果表明:1個培養(yǎng)周期內(nèi)，根誘導的愈傷組織干重與β-蛻皮甾酮積累量顯著高于葉誘導的愈傷組織;5代連續(xù)培養(yǎng)的懸浮細胞在第4代生長比較穩(wěn)定。在細胞培養(yǎng)的第6d加入2mmo1/L NaHS溶液、0.5mmol/L SNP溶液處理12hr，發(fā)現(xiàn)H2S和NO均促進了細胞中β-蛻皮甾酮的積累，過長的處理時間、過高或過低的供體溶液濃度均對細胞中β-蛻皮甾酮的積累表現(xiàn)抑制作用。
　　

4、2、利用Illumina高通量測序技術對匍枝筋骨草進行了轉(zhuǎn)錄組測序和de novo組裝，并對得到的Unigenc進行了功能注釋、分類及代謝通路分析，結果表明:得到N50值為934bp、平均長度為680bp的匍枝筋骨草Unigene共68085條，將其與NCBI的NR和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，分別有46924條和28715條Unigene與其他物種的基因具有同源性。利用COG數(shù)據(jù)庫可將有關的15495條匍枝筋骨草的Unige

5、ne分成25個類別，KEGG數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)共有26618個Unigene參與128種代謝通路，在甲羥戊酸途徑和甾族化合物合成途徑分別找到了36個和64個與植物蛻皮激素合成相關的Unigene。
　　3、利用Illumina高通量測序技術對H2S、NO誘導的匍枝筋骨草cDNA文庫進行了差異基因表達譜分析，結果表明:H2S誘導下顯著差異表達基因（|log2Ratio|≥2）達3012個，其中有上調(diào)表達基因1311個，下調(diào)表達基因170

6、1個;NO誘導下差異表達基因達755個，其中有上調(diào)表達基因450個，下調(diào)表達基因305個。H2S處理后差異表達倍數(shù)在10倍(|log2Ratio|＞10)以上的差異表達基因有181個，其中上調(diào)基因140個，下調(diào)基因41個;NO處理后差異表達倍數(shù)在10倍以上的差異表達基因有9個，且均上調(diào)表達。對差異表達基因的功能注釋表明，它們主要被定位于膜結構上，執(zhí)行分子活性、催化活性和氧化還原酶等功能，參與了對刺激與脅迫的應答等生物學過程;此外，在植物

7、蛻皮激素生物合成與代謝、信號轉(zhuǎn)導、次生代謝產(chǎn)物合成等生物學過程分別注釋到不同數(shù)量的差異表達基因。Pathway代謝通路分析表明，差異表達基因極顯著地被注釋到代謝途徑與次生代謝產(chǎn)物生物合成2條途徑中。在與植物蛻皮激素合成有關的甾族化合物和萜類化合物的生物合成途徑中均顯著富集到差異表達基因。
　　4、利用iTRAQ技術對H2S、NO誘導的匍枝筋骨草的差異蛋白質(zhì)進行了鑒定與分析，結果表明:H2S誘導后鑒定出差異蛋白364個，其中上調(diào)蛋白

8、質(zhì)179個，下調(diào)蛋白質(zhì)185個;NO誘導后鑒定出差異蛋白質(zhì)141個，其中64個上調(diào)，77個下調(diào)。對差異蛋白質(zhì)功能注釋表明，這些蛋白主要被定位于細胞器中，執(zhí)行催化與結合功能，參與了代謝過程、細胞過程、刺激響應等生物學過程。對差異蛋白質(zhì)參與的pathway通路分析表明，它們被顯著富集于代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代謝等途徑上，這些代謝途徑均直接或間接地參與了匍枝筋骨草植物體中的代謝產(chǎn)物的合成與代謝過程。對轉(zhuǎn)錄組與