內生細菌EBS05的GFP標記及其誘導番茄抗中國番茄黃化曲葉病毒的研究.pdf

1、生防細菌 EBS05是一株樟樹內生枯草芽胞桿菌，具有較強的根際定殖能力，且對多種植物病原菌具有穩(wěn)定的拮抗活性，其產生的脂肽類抗生素Surfactin A是誘導煙草抗煙草花葉病毒的有效激發(fā)子，并通過激活SA信號轉導途徑誘導煙草產生系統(tǒng)抗病性，顯示出良好的生防應用潛力。為了進一步明確內生細菌 EBS05的生防機理，本研究采用綠色熒光蛋白基因標記技術和抗生素標記法，研究了菌株 EBS05在番茄根表以及番茄體內和根際的定殖動態(tài)；以番茄品種江蔬1

2、4號為試驗材料，采用RT-PCR和Real time PCR技術，研究了菌株EBS05對番茄植物的促生作用及其對番茄抗中國番茄黃化曲葉病毒的誘導抗性。結果如下：
　　1、利用電擊轉化法將攜帶質粒gfpmut3a基因的穿梭載體pGFP4412導入菌株EBS05，獲得了成功表達GFP的標記菌株EBS05-gfp。菌株EBS05-gfp可有效定殖于番茄根部表面。生物學特性檢測結果表明，EBS05-gfp的生長曲線、生物膜形成能力及抗菌活

3、性均與野生菌株一致；EBS05在番茄植株體內和根際的定殖動態(tài)測定結果表明，EBS05在番茄根、莖內均能有效定殖，其在番茄根和莖內的定殖數(shù)量均表現(xiàn)為接種初期逐漸增加，至接種后第14 d達到最高峰。同時，菌株EBS05具有較強的根際定殖能力，以菌體濃度為108 cfu/mL的菌懸液灌根處理后2~28 d，菌株EBS05在土壤中的定殖量始終維持在106 cfu/g·FW以上。
　　2、通過盆栽試驗，測定了菌株 EBS05對番茄植物的促生

4、作用，并初步探討了其促生機理。結果表明，EBS05對番茄植物具有明顯的促生效果。菌株EBS05可誘導番茄體內擴張蛋白基因 LeEXP2、LeEXP5和LeEXP18的持續(xù)增量表達，表明 EBS05可能通過誘導擴張蛋白基因的增量表達促進番茄植物生長。同時，EBS05灌根處理后，番茄根際土壤中細菌和放線菌數(shù)量顯著增加，真菌數(shù)量在處理初期增加，但在處理后期明顯降低，根際土壤脲酶和磷酸酶活性明顯提高，表明 EBS05對番茄的促生作用也可能與其改

5、變根際土壤微生物區(qū)系，提高土壤酶活力有關。
　　3、內生細菌EBS05能有效誘導番茄對中國番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)抗性。EBS05誘導處理后，番茄黃化曲葉病毒病發(fā)病時間延遲，病害明顯減輕，誘導抗病性效果達53.60％。
　　4、運用RT-PCR和Real time PCR技術研究了EBS05對番茄誘導抗性的信號轉導途徑。結果表明，EBS05誘導處理后，番茄體內SA信號轉導途徑下游標記基因NPR1和PR1均在挑戰(zhàn)接種后第1d被激

6、活，并持續(xù)增量表達，至第7d時，其相對表達量達到最高峰值，分別比對照增加了16倍和13倍，由此推測，內生細菌EBS05誘導番茄對中國番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)抗性是通過SA信號轉導途徑實現(xiàn)的。同時，在挑戰(zhàn)接種后第5 d，JA信號轉導途徑下游的標記基因Coi1被激活，且增量表達，表明在EBS05誘導番茄對中國番茄黃化曲葉病毒系統(tǒng)抗性的信號轉導途徑過程中，可能存在SA信號途徑和JA信號途徑的交叉協(xié)同作用。
　　5、采用RT-PCR技術研究

7、了EBS05對番茄體內病程相關蛋白的誘導作用。結果表明， EBS05可誘導番茄體內PR1、PR2和PR3基因持續(xù)增量表達，并有效激活PR5基因的誘導表達。EBS05誘導處理后，番茄體內β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質酶活性均明顯高于對照，分別于挑戰(zhàn)接種后第7d和第9d達到活性峰值。
　　6、分別采用比色法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法，測定了防衛(wèi)相關酶活性及其同工酶的變化。結果表明，EBS05誘導處理后，番茄體內超氧化物歧化酶（SOD）、多酚

8、氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均顯著高于對照健康植株，過氧化物酶（POD）活性在誘導處理后1~5d略有下降，但是從誘導處理后第7d起，活性迅速升高，其活性值始終顯著高于對照，而EBS05誘導處理再挑戰(zhàn)接種后，SOD、POD、PPO和PAL活性活性均明顯高于對照，結合番茄黃化曲葉病毒病的病程分析，菌株 EBS05誘導處理后番茄植物黃化曲葉病毒病害表現(xiàn)延遲和發(fā)病程度減輕與番茄體內防衛(wèi)相關酶活性的提高有一定的相關性；EBS05