生酮飲食對杏仁核點燃癲癇形成的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　 癲癇(Epilepsy)是一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)常見病，其特點是神經(jīng)元的異常放電。臨床上大多數(shù)癲癇患者可以接受藥物治療控制癲癇發(fā)作，但仍有20％～30%的患者經(jīng)藥物治療后難以得到有效控制。雖然抗癲癇藥不斷研發(fā)，但對于難治性癲癇，新型抗癲癇藥治療的療效仍然有限，需要尋找其它的治療手段和方法。生酮飲食(Ketogenicdiet，KD)成為了研究的熱點。
　　 KD是一種高脂肪、低碳水化合物、低蛋白的飲食，目前認(rèn)

2、為KD是一種治療藥物難治性癲癇的安全有效的治療手段，它對多種癲癇和癲癇綜合癥有效。盡管目前臨床證實KD治療癲癇有效，但KD的機(jī)制并不明確。研究KD的機(jī)制能讓KD的過程更簡化、更合理，減少潛在的嚴(yán)重副作用，提高對正常腦和癲癇活動時的代謝及生理基礎(chǔ)的認(rèn)識。進(jìn)一步驗證KD，也能為今后其它的治療手段提供參考。
　　 動物實驗是研究KD機(jī)制的重要手段，點燃模型能很好模擬人類復(fù)雜部分性及繼發(fā)全面性顳葉癲癇，除了能根據(jù)實驗需要選擇多個刺激點以

3、外，它還能用于研究點燃建立過程中的各個時間點的變化，在研究癲癇的發(fā)生過程中有其它模型無法比擬的優(yōu)勢，但目前尚無KD作用于杏仁核點燃過程的研究。本研究擬選用杏仁核電點燃癲癇的模型來研究KD在抗癲癇形成過程中的作用，并觀察KD對癲癇形成過程的神經(jīng)保護(hù)作用及對苔蘚纖維發(fā)芽的作用。
　　 癲癇放電會導(dǎo)致大量的激活后效應(yīng)，包括各種神經(jīng)遞質(zhì)、受體、離子通道、細(xì)胞內(nèi)信使和神經(jīng)因子的mRNA和蛋白的改變。目前認(rèn)為BDNF參與及調(diào)節(jié)了與癲癇的病理

4、生理有關(guān)的許多機(jī)制，包括神經(jīng)生長、神經(jīng)突觸的形成或調(diào)節(jié)興奮性及抑制性的遞質(zhì)。糖酵解抑制劑2DG和FDP都能影響B(tài)DNF的基因表達(dá)，我們?nèi)圆磺宄﨣D是否直接通過抑制BDNF的表達(dá)來發(fā)揮抗癲癇形成的作用。GABAA受體主要位于突觸后膜上，介導(dǎo)快速突觸后抑制。在癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中，BDNF調(diào)節(jié)JAK/STAT3通路影響GABAAα1亞單位表達(dá)的下降。STAT3通路是顳葉癲癇的形成過程中一條重要的細(xì)胞傳導(dǎo)途徑，參與顳葉癲癇突觸可塑性的重建機(jī)制。

5、我們推測BDNF可能在KD抑制杏仁核點燃及KD對海馬神經(jīng)元的保護(hù)和對苔蘚纖維發(fā)芽的抑制過程中發(fā)揮了調(diào)控作用，并有可能是通過STAT3通路影響GABAA受體起作用的。
　　 第一部分，生酮飲食對杏仁核電點燃模型的作用
　　 目的：
　　 觀察生酮飲食在杏仁核慢性點燃過程中對癲癇形成的作用，同時，觀察生酮飲食對杏仁核點燃模型海馬及旁海馬區(qū)神經(jīng)元丟失和對海馬苔蘚纖維發(fā)芽的影響。
　　 方法：
　　 1.

6、P28天SD大鼠按體重配對后分入KD組及ND組，喂食Ketocal及正常食物各4周，每隔2天測定體重，每周測定血β-羥丁酸。P56天手術(shù)，電極植入基底旁杏仁核，術(shù)后休息10天，進(jìn)入電點燃程序。
　　 2.兩組大鼠測定初始后放電閾值(ADT)，每天1次予以各自的初始ADT為刺激強(qiáng)度的電流刺激，誘發(fā)出癲癇發(fā)作，共20天。每天記錄行為、根據(jù)Racine分級判定刺激后發(fā)作等級、后放電時程(ADD)、大發(fā)作潛伏期(GSL)等參數(shù)，每隔5天

7、測定一次ADT。
　　 3.經(jīng)麻醉灌注后，兩組大鼠各取刺激前(Sti0)和刺激20次(Sti20)后兩小時腦組織標(biāo)本，處理后冰凍切片，行Nissl染色和Timm染色，觀察海馬及旁海馬區(qū)神經(jīng)元丟失情況及海馬內(nèi)分子層苔蘚纖維發(fā)芽情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.兩組大鼠喂養(yǎng)過程中體重均增加，但KD組大鼠體重明顯低于ND組。KD組大鼠除了皮毛油性多、脫毛外，其它生物學(xué)及行為學(xué)特征上和ND組比較并無顯著區(qū)別。血β羥丁酸比較

8、顯示KD大鼠進(jìn)食生酮飲食后血酮體水平很快明顯增高，1周后達(dá)到持續(xù)酮血癥的穩(wěn)定狀態(tài)，而ND組大鼠基本保持在一個相對比較低的酮體狀態(tài)。
　　 2.隨著刺激次數(shù)的累加，兩組大鼠行為學(xué)上均出現(xiàn)一系列的變化，發(fā)作等級總體上不斷增加，ADD不斷延長。生酮飲食顯著延緩杏仁核點燃過程發(fā)作等級和ADD的增加。KD組停留在0級、2級的天數(shù)長于ND組。KD組達(dá)到2、3、4、5級所需要的刺激數(shù)均多于ND組。KD組比ND組在部分性癲癇階段(1～3級)停留

9、更長的時間，KD組發(fā)生大發(fā)作的發(fā)生率比ND組低。一旦被點燃，兩組大發(fā)作的潛伏期無差異。隨著刺激次數(shù)的增加，兩組大鼠均出現(xiàn)ADT逐漸降低，KD對第5天的ADT降低有減緩作用，而這種作用在第10天和第15天消失。
　　 3.點燃前神經(jīng)元密度KD組雙側(cè)海馬CA1區(qū)和刺激同側(cè)DG區(qū)的神經(jīng)元密度比ND組對應(yīng)區(qū)域要小，但兩組內(nèi)嗅皮層和梨狀皮層神經(jīng)元密度無差異。
　　 4.隨著電刺激次數(shù)的逐漸增加，ND組大鼠海馬及旁海馬區(qū)神經(jīng)元密度顯

10、著降低，在旁海馬區(qū)，ND組大鼠刺激同側(cè)梨狀皮層神經(jīng)元丟失，而刺激前后對側(cè)梨狀皮層神經(jīng)元無明顯丟失。刺激同側(cè)和刺激對側(cè)的內(nèi)嗅皮層神經(jīng)元均有不同程度丟失。電流刺激20次后，KD組相比于ND組能減少同側(cè)海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元丟失。但在CA、DG區(qū)或海馬旁區(qū)，KD沒有顯示出這種保護(hù)作用。
　　 5.兩組大鼠刺激前同側(cè)或刺激對側(cè)海馬CA3區(qū)Timm評分組間比較無顯著差異，同一組內(nèi)刺激同側(cè)與刺激對側(cè)也無差異。電流刺激20次后，ND組刺激同側(cè)T

11、imm分值有增高。KD組刺激同側(cè)或?qū)?cè)刺激前后無變化。
　　 結(jié)論：
　　 1.KD在杏仁核點燃模型癲癇的形成過程中有抗癲癇發(fā)生作用，可能是通過抑制后放電的形成起作用，這種作用主要發(fā)生在癲癇的部分性階段。
　　 2.KD能減少杏仁核點燃模型中輕-中度的海馬區(qū)神經(jīng)元的丟失，但對旁海馬皮層無保護(hù)作用。
　　 3.KD可能通過抑制海馬的MFS而起到抗癲癇發(fā)生的作用。
　　 第二部分，生酮飲食抗癲癇發(fā)生機(jī)

12、制的初步探討
　　 目的：
　　 揭示KD在杏仁核點燃癲癇形成過程中通過對BDNF/STAT3/GABAA受體的影響來發(fā)揮抗癲癇形成或神經(jīng)保護(hù)的作用。
　　 方法：
　　 1.通過Real-timeqPCR測定喂食ND及KD兩組大鼠海馬杏仁核點燃模型各個時間點(電刺激0次、6次、12次、20次)BDNF、STAT3、GABAAα1受體(Gabral)和GABAAα4受體(Gabra4)基因mRNA表達(dá)的變

13、化；
　　 2.通過Westernblot方法半定量檢測兩組大鼠海馬杏仁核點燃各個時間點(電刺激0次、6次、12次、20次)BDNF、總STAT3蛋白及磷酸化的pSTAT3的蛋白表達(dá)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.喂食正常食物大鼠BDNFmRNA隨著杏仁核點燃過程的發(fā)展增高，在電刺激12次和20次相比電刺激前出現(xiàn)表達(dá)量的明顯增高；KD組大鼠BDNF的增高不明顯，在電刺激12次和電刺激20次，BDNF的mRNA表達(dá)

14、量均低于ND組。
　　 2.隨著點燃次數(shù)的增加，正常對照大鼠的BDNF蛋白表達(dá)量增加，在KD組大鼠中，BDNF也出現(xiàn)隨點燃過程的發(fā)展而表達(dá)增高的趨勢，相比于ND大鼠，KD組在點燃第6次BDNF的蛋白量較少。
　　 3.隨著電刺激的次數(shù)的增加，ND組大鼠STAT3mRNA表達(dá)量基本無變化；KD組大鼠在電刺激6次、12次和20次STAT3的mRNA表達(dá)量均高于同一時間點ND組。
　　 4.ND組大鼠總的STAT3蛋白

15、量基本無變化，而pSTAT3的表達(dá)量隨著時間逐漸增加；KD組大鼠pSTAT3在點燃早期就處于相對較高的表達(dá)量，隨著點燃的發(fā)展，pSTAT3的表達(dá)量基本保持不變。
　　 5.兩組大鼠的Gabra1和Gabra4基因表達(dá)在杏仁核點燃各個時間點變化均無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.杏仁核點燃過程中ND大鼠BDNF的基因表達(dá)和蛋白翻譯都呈現(xiàn)動態(tài)增高改變，但兩者并不平行：KD對BDNFmRNA表達(dá)的影響主要發(fā)生在點