Numb分子在腸粘膜屏障形成中的作用及其機制研究.pdf

1、背景&目的
　　 腸黏膜屏障包括：機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障。腸粘膜粘液屏障是上皮細胞表面覆蓋的由粘蛋白形成的水化的凝膠樣粘液，而腸黏膜上皮屏障是腸上皮本身及其緊密連接構成的在體內外環(huán)境之間形成一種組織學屏障，它們都具有機械性的保護作用。Numb分子因其能夠不對稱的分布到干細胞的兩個子代細胞，并能夠通過抑制Notch信號通路而使子代細胞具有不同的“命運”而引起人們的廣泛關注。既往研究顯示Numb表達在包括乳腺，肺，睪

2、丸，唾液腺等在內的大多數組織上，但Numb在腸上皮細胞的表達及其功能目前還沒有報道。我們預實驗發(fā)現Numb并非表達在腸隱窩底干細胞上，而是普遍的表達在沿著隱窩-絨毛軸的所有上皮細胞上。既往研究發(fā)現，Numb能夠調節(jié)細胞的分化，調節(jié)細胞粘附，細胞遷移和細胞極性。在腸粘膜上皮細胞上，Numb是否能夠通過抑制Notch通路促進腸上皮細胞粘蛋白Muc2的分泌及腸粘膜屏障的形成，以及Numb能否通過調節(jié)腸上皮細胞間頂端連接復合體(Apicalju

3、nctional complex，AJC)的組裝而維持腸粘膜上皮細胞屏障的完整性目前還不清楚。
　　 圍繞以上問題，本研究揭示了Numb分子與Notch通路相關分子Hes1，Hath1的表達定位關系。通過干擾Numb分子的表達揭示了其在腸上皮細胞中對Notch通路的抑制作用，及其對腸上皮細胞LS174T細胞杯狀細胞表型的影響。利用Caco-2單層細胞模型，揭示了Numb在腸上皮單層細胞屏障形成中的作用，并揭示了其通過抑制肌球蛋白

4、輕鏈磷酸化及改變細胞微絲骨架的結構影響上皮細胞屏障通透性的作用機制。
　　 方法
　　 1.采用RT-PCR和Western blot的方法檢測Numb-PRRL和Numb-PRRS在腸上皮細胞系和腸粘膜細胞的表達，免疫組織化學檢測Numb，Hes1，Hath1，Muc2在小鼠腸粘膜上皮細胞分布，揭示它們在腸粘膜上皮細胞的定位關系，并通過AB染色顯示其與杯狀細胞的定位關系。
　　 2.構建干擾質粒pRNAT-U6

5、.1-shRNA-Numb，轉染LS174T細胞，篩選穩(wěn)定轉染細胞克隆，熒光素酶質粒pGa981-6檢測干擾Numb表達對Notch活性的影響，及其下游靶基因Hes1，Hath1表達的影響。
　　 3.MTT實驗檢測干擾Numb表達對細胞增殖的影響，RT-PCR，Western blot及免疫熒光染色檢測Numb對Muc2表達的影響，PAS染色檢測Numb對LS174T細胞粘液分泌的影響。
　　 4.RT-PCR和Wes

6、tern blot的方法檢測Numb在腸上皮細胞系Caco-2中的表達，免疫熒光染色檢測其與粘附連接分子ZO-1，E-cadherin及Par3的表達定位關系，免疫共沉淀檢測其與E-cadherin及Par3之間的相互作用。
　　 5.干擾Numb分子的表達，TEER和FITC-Dextran滲透實驗檢測Numb分子在腸單層上皮細胞屏障通透性中的作用。鈣轉換實驗和TNF-a/INF-γ刺激實驗驗證Numb在AJC組裝和維持細胞連

7、接完整中的作用。
　　 6.免疫熒光染色檢測抑制Numb表達對鈣轉換試驗前后Caco-2細胞F-actin結構的影響，Western blot檢測在生理和病理條件下，抑制Numb表達對細胞連接相關蛋白ZO-1，Occludin，E-cadhern，β-catenin，Claudin-1，Claudin-2的表達變化，并檢測對Caco-2細胞肌球蛋白輕鏈磷酸化水平的影響。
　　 7.DSS誘導小鼠潰瘍性結腸炎動物模型，HE

8、染色檢測結腸組織形態(tài)變化，免疫熒光染色檢測炎癥條件下Numb在結腸上皮細胞的表達變化。
　　 結果
　　 1.Numb_PRRL和Numb-PRRS亞型在腸上皮細胞系和腸粘膜上皮細胞內都有表達，Numb與Notch通路相關分子Hes1，Hath1在腸粘膜上皮細胞存在共定位關系，與Muc2和AB染色陽性的杯狀細胞也有共定位關系。
　　 2.序列測定證實pRNAT-U6.1-shRNA-Numb成功構建，轉染并經G4

9、18篩選出穩(wěn)定細胞克隆，熒光素酶質粒pGa981-6檢測發(fā)現Numb能夠抑制Notch通路活性，抑制Hes1表達，促進Hath1表達。
　　 3.Numb抑制腸上皮細胞增殖；促進LS174T表達杯狀細胞分子標志物Muc2的表達，PAS染色發(fā)現Numb促進LS174T細胞粘液的分泌。
　　 4.腸上皮細胞系Caco-2表達Numb，Numb與ZO-1，E-cadherin及Par3分子共定位，IP檢測發(fā)現Numb與E-ca

10、dherin和Par3之間存在相互作用。
　　 5.抑制Numb分子的表達能夠增加Caco-2上皮細胞屏障通透性。鈣轉換和TNF-a/INF-γ刺激實驗證實Numb在AJC組裝和維持細胞連接完整性中發(fā)揮作用。
　　 6.抑制Numb表達能夠改變鈣轉換試驗前后Caco-2細胞F-actin的結構；Numb對正常和炎癥條件下Caco-2細胞內ZO-1，Occludin，E-cadhern，β1-catenin，Claudin

11、-1的蛋白水平沒有影響，但能夠升高Claudin-2的水平；Numb能夠抑制Caco-2細胞肌球蛋白輕鏈磷酸化。
　　 7.HE染色發(fā)現DSS成功誘導小鼠結腸炎癥反應，炎癥條件下Numb在結腸上皮細胞的表達減少，且在細胞內分布紊亂。
　　 結論
　　 Numb能夠通過抑制Notch通路促進腸上皮細胞粘蛋白Muc2的表達及粘液的分泌，參與腸粘膜粘液屏障的形成；同時Numb通過抑制肌球蛋白輕鏈的磷酸化，調節(jié)腸上皮細胞