靶向腫瘤壞死因子β小分子抑制劑的篩選及其功能鑒定.pdf

1、第一部分重組人腫瘤壞死因子β原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及活性測(cè)定
　　目的:構(gòu)建腫瘤壞死因子β的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行TNFβ的誘導(dǎo)表達(dá)，為后續(xù)TNFβ的功能及其與小分子抑制劑相互作用的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:通過構(gòu)建PAYZ-STII-hTNFβ-6his，pET44 hTNFβ-6his兩種不同的原核表達(dá)載體，并分別轉(zhuǎn)化16C9和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)不同方法誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并比較兩種載體中hTNFβ表達(dá)量大小的

2、差異，選出蛋白表達(dá)量最大的載體和菌株組合，并利用SDS-PAGE和Westernb Blot技術(shù)檢測(cè)并鑒定，比較可溶蛋白和包涵體蛋白比例。利用高濃度尿素(8M)溶解包涵體，并利用稀釋復(fù)性技術(shù)得到具有生物學(xué)活性的hTNFβ，純化后的hTNFβ蛋白在小鼠成纖維細(xì)胞系L929上測(cè)試其殺傷活性。
　　結(jié)果: SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物可溶性蛋白比例較低，大部分以包涵體形式存在，透析復(fù)性逐級(jí)降低尿素的過程中出

3、現(xiàn)蛋白沉淀現(xiàn)象，改換稀釋復(fù)性方法復(fù)性后，蛋白復(fù)性液在L929細(xì)胞系上做活性測(cè)試，復(fù)性后的蛋白溶液可以引起L929細(xì)胞的凋亡，具有一定的生物學(xué)活性。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建PAYZ-STII-hTNFβ-6his，pET44 EK/LIC-hTNF-6his兩種原核表達(dá)載體，并利用包涵體變性和復(fù)性技術(shù)得到了具有生物學(xué)活性的腫瘤壞死因子β蛋白。
　　第二部分靶向腫瘤壞死因子β小分子抑制劑的篩選及其功能鑒定
　　目的:通過計(jì)算機(jī)

4、虛擬篩選和細(xì)胞活性篩選，獲得能靶向抑制腫瘤壞死因子β(TNFβ)的細(xì)胞毒活性的小分子抑制劑。
　　方法:根據(jù)TNFβ與腫瘤壞死因子Ⅰ型受體(TNFR1)結(jié)合的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)，采用計(jì)算機(jī)虛擬篩選方法初步選擇對(duì)接結(jié)果較好的105個(gè)小分子化合物（C1-C105），并對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞活性篩選;MTT法檢測(cè)小分子化合物抑制TNFβ對(duì)L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定小分子化合物對(duì)TNFβ引起的細(xì)胞凋亡的抑制作用;采用碘化丙啶(PI)單染和流式

5、分析技術(shù)檢測(cè)小分子化合物對(duì)L929細(xì)胞周期的影響;采用WesternBlot和雙轉(zhuǎn)盤激光共聚焦顯微鏡分析小分子化合物對(duì)TNFβ引起的下游Caspase3活化的抑制作用。
　　結(jié)果: C35能有效抑制TNFβ引起細(xì)胞毒作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性（半數(shù)抑制濃度=8.19μmol/L）;C35具有較低的細(xì)胞毒性，且對(duì)L929細(xì)胞周期無影響;C35能阻斷TNFβ與其受體結(jié)合后引起的細(xì)胞凋亡通路，顯著抑制TNFβ引起的L929細(xì)胞凋