FG020326及酪氨酸激酶抑制劑lapatinib和sunitinib逆轉腫瘤多藥抗藥性作用及其機制研究.pdf

1、研究背景及目的：腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生原發(fā)和繼發(fā)耐藥是腫瘤有效治療的主要障礙。多種機制參與腫瘤細胞耐藥性的形成，包括藥物作用靶點的改變，DNA損傷后修復能力增強，腫瘤細胞凋亡逃避，細胞周期檢測點改變，化療藥物代謝酶誘導性活性增強或表達升高以及腫瘤細胞對化療藥物的攝取減少主動外排增加等。其中ATP結合盒膜通道轉運蛋白(ATP—bindingcassette(ABC)transporters)能量依賴性將結構和作用機制不同的抗腫瘤藥物外排到

2、腫瘤細胞外是產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)的主要原因。在人類基因中，目前發(fā)現(xiàn)它共有48個成員，依據(jù)它們序列的相似性被分為7大類，從ABCA至ABCG。在這個家族中，與腫瘤MDR關系最為密切的是P—糖蛋白(P—glycoprotein，P—gp/MDR1/ABCB1)、多藥耐藥性相關蛋白(multidrugresistanceassociated—proteins，MRPs/ABCCs)和乳腺癌耐藥蛋白(

3、breastcancerresistanceproteinBCRP/ABCG2/MXR)。ABCB1由12個跨膜結構域和2個ATP結合盒組成，ABCC1和ABCB1結構相似，但在N—末端還包含5個跨膜結構域，而ABCG2則只包含6個跨膜結構域和1個位于N—末端的ATP結合盒，屬于半轉運體。這些ABCtransporters在腫瘤細胞膜過度表達時會結合抗癌藥物，同時其ATP結合位點結合ATP，ATP水解釋放能量促使藥物被泵到胞外，使細胞內(nèi)

4、藥物濃度始終維持在較低水平，腫瘤細胞從而獲得耐藥性。目前研究最為深入的是ABCB1介導的MDR。 理論上克服MDR有多種方法：如開發(fā)對腫瘤MDR細胞不具抗藥性的新型抗癌藥物；尋找高效、低毒對抗癌藥物藥代動力學無影響的MDR逆轉劑與抗癌藥物合用，恢復MDR腫瘤細胞對抗癌藥物敏感性；降低耐藥蛋白表達等。 第一代逆轉劑如環(huán)孢素A和維拉帕米由于自身毒副作用限制了其進一步的研究，第二代逆轉劑如valspodar(PSC833)和b

5、iricodar(VX-710)盡管毒性減少，但由于會干擾聯(lián)合應用抗腫瘤藥物的藥代動力學產(chǎn)生不可預測的毒副作用而限制了進一步的應用。盡管到目前為止真正能夠用于臨床的逆轉劑尚未開發(fā)成功，但根據(jù)定量結構-活性關系(quantitativestructure-activityrelationships，QSARs)和組合化學方法所開發(fā)的具有高特異性逆轉作用的第三代逆轉劑如LY335979，ONT-093，R101933，GF120918以及X

6、R9576等在與抗癌藥物合用時很少干擾后者的藥代動力學，這也讓研究者們看到了最終克服MDR的曙光。 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)通過與ATP競爭性結合到酪氨酸激酶催化區(qū)域ATP結合位點從而阻斷酪氨酸激酶磷酸化后下游信號的激活，進而使細胞周期阻滯，抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤細胞的浸潤和遠處轉移，誘導腫瘤細胞凋亡；體外生物化學及細胞評價方法發(fā)現(xiàn)TKIs可以調(diào)節(jié)ABCtransport

7、ers的功能。 本研究對多芳基取代咪唑類化合物FG020326的逆轉機制，酪氨酸激酶抑制劑lapatinib和sunitinib與ABCtransporters的關系進行了研究。 研究方法：細胞毒測定用MTT法；以KBv200細胞建立裸鼠移植瘤模型探討FG020326和lapatinib體內(nèi)逆轉活性；蛋白測定用Westernblotting；ABCB1和ABCG2在mRNA表達水平用RT-PCR法測定；RNA干擾法觀察沉

8、默Erk后對KBv200細胞存活的影響；阿霉素，羅丹明123積累以流式細胞儀測定；高壓氮氣破裂法制備細胞膜泡并用快速濾膜過濾法進行膜泡藥物輸送實驗測定lapatinib和sunitinib對ABCB1和ABCG2介導藥物轉運的影響；釩敏感法測定FG020326對ABCB1ATPase活性，lapatinib對ABCB1和ABCG2ATPase活性的影響；[125I]-Iodoarylazidoprazosin(IAAP)和[3H]azi

9、dopine光親和標記實驗探討lapatinib與ABCB1和ABCG2的作用位點以及FG020326與ABCB1作用位點情況；藥代動力學測定用HPLC法；超速離心法制備人肝微粒體并用HPLC法測定FG020326或lapatinib對CYP3A4活性的影響。 結果: 1.以ABCB1高表達細胞MCF—7/Adr和KBv200及相應親本敏感細胞株MCF—7和KB，ABCC1高表達細胞KB—CV60及親本敏感細胞KB—3-

10、1，ABCC4高表達細胞NIH3T3/MRP4-2及親本敏感細胞NIH3T3，ABCG2高表達細胞S1-M1-80及敏感細胞S1，LRP高表達細胞SW1573/2R120和敏感細胞SW1573為模型，體外評價FG020326逆轉活性。FG020326濃度依賴性地增加ABCB1底物紫杉醇，阿霉素和長春新堿對MDR細胞MCF—7/Adr和KBv200的細胞毒作用，而對非ABCB1底物順鉑和5-FU的細胞毒作用則無明顯影響；FG020326濃

11、度依賴性地增加阿霉素和羅丹明123在MDR細胞中積累，但不影響阿霉素和羅丹明123在相應敏感細胞中積累，同時顯著抑制ABCB1對阿霉素的外排，說明FG020326通過抑制ABCB1藥物外排泵功能恢復MDR細胞對化療藥物的敏感性。 FG020326濃度依賴性地抑制[3H]azidopine對ABCB1的光結合性標記，共聚焦顯微鏡結果也顯示FG020326直接與ABCB1結合發(fā)揮逆轉作用；ATPase活性實驗則顯示FG020326濃

12、度依賴性地抑制ABCB1ATPase活性，表明FG020326可能不是ABCB1底物。體內(nèi)逆轉MDR研究表明FG020326(100mg/kg，p.o)與紫杉醇(18mg/kg，i.p)聯(lián)合可以顯著增加紫杉醇對以KBv200細胞建立的裸鼠移植瘤的抗腫瘤活性，抑瘤率為51.7％，而與生理鹽水對照組相比，F(xiàn)G020326或紫杉醇單獨用藥則無明顯抑瘤作用，重要的是聯(lián)合用藥組未見明顯增加紫杉醇的毒副作用。FG020326(100mg/kg，p.

13、o)無論是先于紫杉醇(18mg/kg，i.v)1h灌胃還是和紫杉醇同時尾靜脈注射(FG020326，30mg/kg，p.o，紫杉醇，18mg/kg，i.v)均對紫杉醇的藥代動力學無顯著影響。 下調(diào)ABCB1表達也可逆轉ABCB1介導的MDR，但FG020326不影響ABCB1在KBv200細胞中的表達；FG020326對ABCC1，ABCC4，ABCG2和LRP介導的MDR無明顯逆轉作用。 2.體外評價中l(wèi)apatini

14、b不僅顯著逆轉ABCG2轉染細胞對ABCG2底物米托蒽醌的耐藥性，而且顯著恢復經(jīng)藥物誘導表達突變型ABCG2細胞S1-M1-80對米托蒽醌和拓撲替康的藥物敏感性；Lapatinib還顯著增強ABCB1過表達MDR細胞對阿霉素，長春新堿，紫杉醇和柔紅霉素的敏感性；重要的是，lapatinib體外顯著增加ABCB1高表達白血病患者白血病細胞對阿霉素和柔紅霉素的藥物敏感性；盡管lapatinib與阿霉素合用對MCF—7細胞，與米托蒽醌或拓撲替

15、康合用對S1細胞產(chǎn)生小的協(xié)同作用，但不改變非ABCB1和ABCG2底物順鉑對MDR細胞的細胞毒作用；Lapatinib對ABCC4和LRP介導的MDR無明顯逆轉作用. 結論： 1.FG020326在體外和體內(nèi)逆轉ABCB1介導的MDR，對ABCC1，ABCC4，ABCG2和LRP介導的MDR則無明顯逆轉作用。 2.FG020326可能不是ABCB1底物，不影響合用抗癌藥物紫杉醇的藥代動力學，通過與ABCB1直接作

16、用抑制ABCB1藥物外排泵功能發(fā)揮逆轉作用，是有開發(fā)前景的第三代MDR逆轉劑。 3.Lapatinib通過抑制ABCB1和ABCG2藥物外排泵功能在體內(nèi)和體外逆轉ABCB1和ABCG2介導的MDR，這種逆轉作用不依賴于lapatinib對EGFR和HER2酪氨酸激酶磷酸化的阻斷作用。 4.Lapatinib可能足ABCB1和ABCG2底物，影響合用紫杉醇的藥代動力學，對于指導臨床聯(lián)合用藥，揭示lapatinib耐藥性的產(chǎn)

17、生提供依據(jù)。 5.Erk1/2磷酸化水平在KBv200細胞的生存中可能不起主要作用。 6.Lapatinib在體外增加ABCB1底物阿霉素和柔紅霉素對ABCB1高表達白血病患者白血病細胞的細胞毒作用，為克服白血病多藥耐藥提供理論依據(jù)。 7.Lapatinib對ABCC4和LRP介導的MDR沒有明顯逆轉作用。 8.Sunitinib通過抑制ABCG2藥物外排泵功能逆轉ABCG2介導的MDR.對指導sunit