異位骨化形成過程動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組學(xué)前期研究.pdf

1、目的：比較兔股骨近端擴髓手術(shù)后，覆蓋擴髓口肌瓣組織內(nèi)注入骨髓組織和保持此類肌瓣血供兩種因素引起髖關(guān)節(jié)周圍異位骨化的作用。驗證兩因素同時施加的手術(shù)建模方法，其誘導(dǎo)異位骨形成的過程是否具有更好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。 方法：選取40只4月齡健康成年雄性新西蘭大白兔，隨機分為4組，每組10只，分批手術(shù)。A組(單純擴髓手術(shù)組)、B組(肌瓣創(chuàng)面覆蓋擴髓口組)、C組(骨髓組織注入無血供肌肉創(chuàng)面覆蓋擴髓口組)、D組(骨髓組織組注入肌瓣創(chuàng)面覆蓋擴髓

2、口組)。比較4種不同建模手術(shù)方式造成的異位骨化的術(shù)后不同時間點的影像學(xué)、血清學(xué)變化以及異位骨組織形成過程的組織結(jié)構(gòu)變化，分別于術(shù)后4周、8周、12周，每組取6只實驗動物攝X線骨盆正位片判斷Brooker分級，比較各組Brooker分級2級以上誘發(fā)率、分級結(jié)果總體分布、組間比較有無差異；每組取2只實驗動物取異位骨組織進行脫鈣后HE染色組織學(xué)檢查和透射電鏡觀察；每組取6只實驗動物檢測血清堿性磷酸酶活性，進行動態(tài)變化的統(tǒng)計描述。 結(jié)果

3、：(1)4組術(shù)后3個時間點X線Brooker分級2級以上總誘發(fā)率和分級水平，有隨時間延長而增加的趨勢。骨髓注入的實驗組的Brooker分級2級以上誘發(fā)率在術(shù)后三個時間點上，均強于未注入骨髓的實驗組，有統(tǒng)計學(xué)差異。保持肌肉組織血供的實驗組Brooker分級2級以上誘發(fā)率在術(shù)后三個時間點上，均強于未保持肌肉組織血供的實驗組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。(2)4種手術(shù)建模方式引起的異位骨化嚴(yán)重程度在三個時間點上X線Brooker分級結(jié)果的組間比較，聯(lián)合干

4、預(yù)組D組均高于實驗對照組A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(A組vs D組：術(shù)后4周P=0.006；術(shù)后8周P<0.001；術(shù)后12周P<0.001)。(3)組織學(xué)結(jié)果顯示，注入骨髓或保證血供的單一干預(yù)因素均能增加成骨早期異位骨化發(fā)生的嚴(yán)重程度水平，其中骨髓注入因素組異位骨化組織學(xué)過程連續(xù)性較保證血供因素組好。聯(lián)合干預(yù)組異位骨化發(fā)生的程度在術(shù)后三個時間點上均重于實驗對照組，且骨化的組織學(xué)過程連續(xù)進行，能夠發(fā)展為成熟異位骨組織。(4)動態(tài)監(jiān)測血清堿性

5、磷酸酶水平的變化趨勢，聯(lián)合X線發(fā)現(xiàn)，有助于判斷異位骨組織成骨活動是否持續(xù)。4組血清ALP水平均值在術(shù)后4周達到峰值，術(shù)后8周、12周逐漸下降。實驗對照組A組下降最快，聯(lián)合干預(yù)組D組下降最慢，術(shù)后12周D組血清ALP水平仍高于其他三組，提示D組的異位成骨活動在術(shù)后12周仍強于其他實驗組。 結(jié)論：本研究改進了兔雙髖創(chuàng)傷后異位骨化動物模型，骨髓注入肌肉組織并保持良好肌肉血供兩因素聯(lián)合施加的手術(shù)方式，使得該模型在影像學(xué)、組織學(xué)、血清學(xué)三

6、方面的檢查結(jié)果更為穩(wěn)定，骨髓注入因素的促異位成骨作用強于保持良好血供因素，后者在異位成骨過程早期與前者有協(xié)同作用。該模型異位骨形成的機制與臨床常見機制相似，且手術(shù)操作容易實現(xiàn)，取材方便，使用臨床常用的驗證指標(biāo)。 目的：通過優(yōu)化骨組織總蛋白提取的方法，減少蛋白質(zhì)的降解、丟失，保持總蛋白提取液中蛋白質(zhì)濃度，特別是小分子量蛋白質(zhì)，降低溶液中金屬離子的濃度，建立符合蛋白質(zhì)組學(xué)實驗要求的骨組織總蛋白提取技術(shù)方法。 方法：取成年新西

7、蘭大白兔股骨近端的正常骨組織及第一部分動物模型中獲得的異位骨，通過對文獻報道的基本研磨提取+透析+丙酮沉淀法的改進，對易提取部分的組織用傳統(tǒng)方法，不易提取部分的組織加入低溫脫鈣、超聲震蕩等步驟進行再提取。對本實驗采用的兩種實驗方法，進行Bradford法蛋白濃度測定、SDS-PAGE質(zhì)譜兼容銀染法進行比較。 結(jié)果：優(yōu)化的提取方法減少提取液中蛋白質(zhì)的降解、丟失，加強對難溶組織中可溶性蛋白質(zhì)的提取，透析和丙酮沉淀降低了溶液中金屬離子