家蠶微孢子蟲檢測(cè)技術(shù)研究及藍(lán)葉蟲微孢子蟲RPB1基因克隆與分析.pdf

1、微孢子蟲（Microsporidia）是一類專性細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真核生物，廣泛感染無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，目前已知的微孢子蟲種類有1300多種，分別屬于160個(gè)屬。家蠶微孢子蟲是Nosema屬的典型代表，感染家蠶后引起的微粒子病是蠶業(yè)生產(chǎn)上的毀滅性疫病，不僅可以寄生家蠶幼蟲、蛹和蛾，并能經(jīng)蠶卵垂直傳播給下一代，對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)尤其是蠶種生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。家蠶微粒子病的檢測(cè)技術(shù)從最早的肉眼鑒定方法發(fā)展到顯微鏡檢查以及血清學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，但近

2、年來(lái)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的新技術(shù)在實(shí)用性等方面存在局限性。因此，目前在蠶業(yè)檢驗(yàn)檢疫中使用的還是顯微鏡檢測(cè)方法。由于現(xiàn)行的母蛾檢驗(yàn)存在檢驗(yàn)樣本與實(shí)際使用商品不對(duì)稱的問(wèn)題，蠶卵檢驗(yàn)勢(shì)必會(huì)取代母蛾檢驗(yàn)，高效、簡(jiǎn)便的蠶卵微粒子病檢驗(yàn)技術(shù)是目前蠶業(yè)生產(chǎn)的迫切需求。
　　本文建立了一種靈敏度較高的家蠶微孢子蟲檢測(cè)方法，成功地將玻璃珠破碎法、FTA卡和 LAMP技術(shù)結(jié)合起來(lái)。首先，使用酸洗玻璃珠將家蠶微孢子蟲破碎，利用FTA卡提取家蠶微孢子蟲基因組DNA

3、；其次，根據(jù)家蠶微孢子蟲的核糖體大亞基LSU rRNA序列設(shè)計(jì)LAMP擴(kuò)增技術(shù)所需的引物；最后，運(yùn)用LAMP法檢測(cè)家蠶微孢子蟲，最低檢測(cè)極限為101個(gè)孢子/mL。本實(shí)驗(yàn)所使用的 LAMP引物不會(huì)對(duì)感染家蠶的主要致病細(xì)菌（靈菌、蘇蕓金桿菌）和真菌（白僵菌、綠僵菌、曲霉）的基因組進(jìn)行假陽(yáng)性擴(kuò)增。應(yīng)用LAMP技術(shù)對(duì)感染微粒子病的家蠶進(jìn)行早期診斷時(shí)，LAMP比常規(guī)的顯微鏡檢查提早24 h左右。在利用LAMP方法檢測(cè)蠶卵微粒子病時(shí)，100％檢出率

4、的蠶卵數(shù)為500粒卵（即499粒健康卵與1粒有毒卵混合）。隨著樣品中蠶卵總個(gè)數(shù)的增加，檢出率呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。將800粒和1000粒卵中混有1粒有毒卵（N.b卵）的實(shí)驗(yàn)樣品在破碎時(shí)平均分裝成兩管，每管各加入1 mLTE buffer，破碎結(jié)束后再將兩管破碎液混合，其余操作不變，檢出率均為100%。1/2管玻璃珠、500粒卵與1mLTE buffer混合時(shí)，在本研究探索建立的實(shí)驗(yàn)條件下可以達(dá)到較好的破碎、抽提和檢測(cè)效果。
　　RPB1

5、（largestsubunitof RNA polymeraseII）基因是負(fù)責(zé)編碼RNA聚合酶II最主要的功能亞基。本研究克隆了藍(lán)葉蟲微孢子蟲 RP B1基因片段，并對(duì)其基因及編碼的蛋白序列的特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。根據(jù)家蠶微孢子蟲RP B1基因序列設(shè)計(jì)6對(duì)同源引物，通過(guò) PC R擴(kuò)增，克隆得到了藍(lán)葉蟲微孢子蟲 RPB1基因片段序列，在GenBank登錄號(hào)為：KJ728831。該基因片段的長(zhǎng)度為2933 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)為2922

6、bp的開(kāi)放讀碼框，預(yù)測(cè)編碼的蛋白質(zhì)由974個(gè)氨基酸組成，蛋白分子量為109.38277 kD，等電點(diǎn)為7.087。藍(lán)葉蟲微孢子蟲RPB1基因片段結(jié)構(gòu)為單外顯子結(jié)構(gòu)，編碼的蛋白含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：RPOLA_N、RNA_pol_Rpb1_4、RNA_pol_Rpb1_5和RNA_pol_Rpb1_6。該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由四種形式組成：α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈和β轉(zhuǎn)角。α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲所占比例相當(dāng)高，延伸鏈主要位于α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲之間

7、。多序列比對(duì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Nosemasp. PA與Nosema bombycis序列相似性高達(dá)99.6%，并與Nosema bombycis具有非常近的親緣關(guān)系，進(jìn)一步證實(shí)了Nosemasp. PA屬于Nosema屬。
　　本研究建立了一種方便快捷、高效且能夠廣泛使用的家蠶微孢子蟲的檢測(cè)方法，為蠶業(yè)生產(chǎn)中微粒子病的檢驗(yàn)檢疫提供了一種新的方法，也可為日后微孢子蟲的進(jìn)一步研究提供了幫助。本研究還對(duì)藍(lán)葉蟲微孢子蟲 RP B1基因