鴨瘟病毒UL41基因原核表達、轉(zhuǎn)錄時相及亞細胞定位.pdf

1、根據(jù)本實驗室構(gòu)建的鴨瘟病毒(DPV) CHv株基因文庫及其測定的序列信息，設(shè)計了UL41基因引物，PCR擴增出鴨瘟病毒CHv株UL41基因(GenBank登錄號EU071040)，對UL41基因的分子特征和稀有密碼子使用情況等做了一系列生物信息學(xué)分析，對UL41基因進行原核表達、蛋白純化和抗體制備、轉(zhuǎn)錄時相分析以及UL41蛋白的亞細胞定位研究，獲得如下結(jié)果:
　　1.鴨瘟病毒UL41基因序列的分子特性分析
　　DPV UL4

2、1基因大小為1497bp，編碼498個氨基酸(aa)。根據(jù)信號肽、跨膜區(qū)及磷酸化位點預(yù)測揭示UL41基因編碼的蛋白既沒有信號肽也沒有跨膜區(qū)，片段有24個潛在磷酸化位點。通過對該基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲和α螺旋比例較大，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)與Flap endonuclease-1(FEN-1)有同源性。此外，進化樹分析發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆隈R立克皰疹病毒屬，與MeHV-1、GaHV-2和GaHV-3進化關(guān)系最近。
　　2.U

3、L41基因的克隆、原核表達、蛋白純化及抗體制備
　　設(shè)計一對引物，PCR擴增了一條長度為1526bp的DNA片段，此片段囊括了完整的UL41基因開放閱讀框(ORF)，將此片段插入pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-UL41。通過EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切pMD19-T-UL41重組質(zhì)粒回收目的片段，再將該目的片段定向插入pET-32a(+)原核表達載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)-UL41。菌液PCR、EcoRⅠ

4、和XhoⅠ雙酶切及測序鑒定重組表達質(zhì)粒pET-32a(+)-UL41正確與否。將鑒定正確的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞誘導(dǎo)表達。重組表達菌在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達得到與預(yù)期大小相同的76kDa6×His重組融合蛋白，此蛋白主要以包涵體形式存在。UL41蛋白最優(yōu)表達條件為30℃搖菌培養(yǎng)加入0.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)10h。重組UL41蛋白的Western-blot檢測說明其能被兔抗DPV陽性血清識別。重組U

5、L41蛋白純化后用于制各兔抗UL41多克隆抗體，瓊脂糖擴散實驗效價為1∶8。該多克隆抗體Western-blot檢測表明能特異識別表達的UL41重組蛋白。
　　3.DPV UL41基因轉(zhuǎn)錄時相
　　DPV感染宿主鴨胚成纖維細胞后，利用熒光定量PCR相對定量法檢測UL41基因轉(zhuǎn)錄的情況，試驗中利用SYBR GreenⅠ作為熒光染料檢測不同時間段收取的細胞樣品。結(jié)果顯示UL41基因6h開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄，36h達到最高峰，54h仍有轉(zhuǎn)