重組肝再生增強(qiáng)因子對(duì)5-6腎切除大鼠模型腎性貧血的影響.pdf

1、目的:腎性貧血是慢性腎衰竭病人常見(jiàn)的并發(fā)癥之一,EPO是治療腎性貧血的主要藥物,但是外源性EPO有諸多不良反應(yīng)(如高血壓、血粘度的升高、血管通路血栓形成、透析管道凝血、高鉀血癥、肌痛、流感樣癥狀等),且尚有部分病人對(duì)rHuEPO反應(yīng)低下。
　　 肝再生增生強(qiáng)因子(augmenter of liver regeneration,ALR)是1994年Hagiya,等從新生大鼠肝臟中純化并克隆出的一種具有熱穩(wěn)定性的非特異性促進(jìn)肝細(xì)胞再

2、生因子,由125個(gè)氨基酸構(gòu)成的小分子蛋白質(zhì),分子量為15 Kdat[2]。ALR具有非種屬、非組織、非器官特異性,在肝臟、腎臟中有高表達(dá)。慢性腎衰竭時(shí)腎臟不能產(chǎn)生足夠的EPO,此時(shí)由于肝臟Kupffer細(xì)胞也能合成分泌EPO,所以肝臟可有一定的代償作用[3,4]。研究發(fā)現(xiàn):肝臟Kupffer細(xì)胞表面有高親和力ALR受體,ALR能促進(jìn)Kupffer細(xì)胞DNA復(fù)制,蛋白合成[4,5]。但是目前尚無(wú)肝再生增強(qiáng)因子(ALR)在慢性腎衰竭中的研究

3、。本課題利用5/6腎切除大鼠模型探討ALR在慢性腎衰竭中的作用,為腎性貧血探索新的治療方法。如果人工合成肝再生增強(qiáng)因子可以治療腎性貧血,將更符合生理要求,可減少rHuEPO的用量及其帶來(lái)的許多不良反應(yīng),為重組肝再生增強(qiáng)因子在臨床上治療腎性貧血提供實(shí)驗(yàn)性理論依據(jù)。有可能使其成為一種理想的治療方案。
　　 方法:將體重150～200g的30只SD大鼠隨機(jī)分為三組,假手術(shù)組(n=10),僅暴露腎包膜,不做腎切除。手術(shù)組(n=20),參

4、照文獻(xiàn)[5][8]的方法制備模型,在嚴(yán)格無(wú)菌條件下,切除右腎,一周后切除左腎2/3。手術(shù)組大鼠術(shù)后飼養(yǎng)一周后總計(jì)成活18只,隨機(jī)分為對(duì)照組(n=9),rhALR組(n=9)。rhALR組大鼠于手術(shù)后12周給予rhALR200μg/kg/d,腹腔注射,對(duì)照組大鼠同時(shí)給予等量生理鹽水腹腔注射。隔日注射1次,共2周。觀察大鼠精神狀態(tài),活動(dòng)度、毛發(fā)光澤度、攝食及死亡情況,每周觀察一次體重,觀察體重變化。各組大鼠于用藥結(jié)束后24小時(shí),氯胺酮麻醉后

5、心臟采血,觀察各項(xiàng)指標(biāo)。應(yīng)用日本SYSMEX型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定血色素(Hb),紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC),紅細(xì)胞壓積(Hct);采用OLYMPUD AU400型生化儀測(cè)定血清尿素氮(BUN、肌酐(Scr);采用OLYMPUS5400型生化儀測(cè)定血清鐵蛋白;采用美國(guó)ADL公司ELISA試劑盒測(cè)定血清EPO水平。Masson染色觀察腎臟病理學(xué)改變,HE染色觀察肝臟病理學(xué)改變。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)肝腎組織中的肝再生增強(qiáng)因子(ALR)、增殖細(xì)胞核

6、抗原(PCNA)。Western印跡法檢測(cè)肝腎組ALR蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1腎臟大體外觀改變,對(duì)照組大鼠術(shù)后殘腎體積增大,被網(wǎng)膜包裹難以剝離。手術(shù)切口瘢痕處內(nèi)陷,其余部分外凸,形狀不規(guī)則。rhALR組亦有上述改變,但較輕。
　　 2外周血象及腎功能變化:假手術(shù)組、對(duì)照組和rhALR組小鼠血Hb(g/L)分別為137.43±0.96、68.72±15.42、113.51±5.83,RBC(×1012/

7、L)分別為7.45±0.42、4.01±1.35、6.05±0.88,HCT(％)分別為46.92±6.33、25.31±2.61、39.42±5.45,BUN(mmol/L)分別為7.52±1.36、25.35±8.91、17.22±5.17,Scr(μmol/L)分別為49.64±6.20、97.72±15.43、68.88±6.84。對(duì)照組與假手術(shù)組相比,Hb、RBC、HCT等下降(P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而血Scr及B

8、UN上升(P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明腎功能損害,造成貧血。rhALR組與假手術(shù)組比較,Hb、RBC、HCT水平仍低,Scr及BUN水平仍高(P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhALR組與對(duì)照組比較,Hb、RBC、HCT等顯著升高(P＜0.05),而血Scr及BUN下降(P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明貧血改善,腎功能損害減輕。
　　 3血清EPO變化假手術(shù)組、對(duì)照組和rhALR組小鼠血EPO值(u/L)分別為

9、12.19±1.87、1.77±0.72、8.64±2.35。對(duì)照組大鼠血清EPO明顯下降,rhALR治療后血清EPO升高,與對(duì)照組比較P＜0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,EPO水平仍低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明rhALR處理后EPO分泌尚未恢復(fù)正常。
　　 4腎臟病理學(xué)變化腎臟大體外觀改變,對(duì)照組大鼠術(shù)后殘腎體積增大,被網(wǎng)膜包裹難以剝離。手術(shù)切口瘢痕處內(nèi)陷,其余部分外凸,形狀不規(guī)則。rhALR組亦有上述改

10、變,但較輕。組織解剖學(xué)改變假手術(shù)組腎臟外觀光滑,腎小球、腎小管、腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常。對(duì)照組大鼠腎臟外觀明顯增大,呈蒼白色,表面凸凹不平,腎盂擴(kuò)張;光鏡下Masson染色顯示鼠腎小球代償性肥大、系膜增生、局灶節(jié)段性腎小球硬化;腎小管萎縮,小管細(xì)胞可見(jiàn)變性、壞死、脫落;腎間質(zhì)膠原成分增多,部分腎間質(zhì)纖維化,局灶淋巴-單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。rhALR組腎小球、腎小管、腎間質(zhì)纖維組織增生病變程度明顯減輕。
　　 5腎組織ALR的表達(dá)

11、變化:假手術(shù)組大鼠腎組織ALR僅在腎小管上皮細(xì)胞有少量表達(dá),表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞包膜及胞漿均勻分布的細(xì)沙粒樣著色。皮質(zhì)區(qū)表達(dá)陰性。與假手術(shù)組相比,對(duì)照組ALR在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)增加(9.53±0.73vs.13.58±0.69,P＜0.05),而rALR組表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)(17.05±1.23vs.13.58±0.69,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(17.05±1.23vs.9.53±0.73,

12、P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在假手術(shù)組及腎衰大鼠腎小球內(nèi)未見(jiàn)ALR表達(dá)。
　　 6肝組織ALR的表達(dá)變化:假手術(shù)組大鼠肝組織ALR僅有少量肝細(xì)胞表達(dá);與假手術(shù)組相比,對(duì)照組肝臟ALR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多(10.00±0.89vs.13.56±1.33,P＜0.01);rALR組ALR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯增多(23.01±1.22vs.13.56±1.33,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(23.

13、01±1.22vs.10.00±0.89,P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7腎組織PCNA的表達(dá)變化:假手術(shù)組大鼠腎組織PCNA僅在腎小管上皮細(xì)胞有極少量表達(dá),與假手術(shù)組相比,對(duì)照組組PCNA表達(dá)(％)增加(0.73±0.08vs.6.08±0.68,P＜0.05),而rALR組表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)(12.30±0.74vs.6.08±0.68,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(12.3

14、0±0.74vs.0.73±0.08,P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 8肝組織PCNA的表達(dá)變化:假手術(shù)組大鼠肝組織PCNA僅在肝細(xì)胞有少量表達(dá),與假手術(shù)組相比,對(duì)照組PCNA表達(dá)增加(2.33±0.11vs.8.27±0.30,P＜0.05),而rALR組表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)(12.19±0.27vs.8.27±0.30,P＜0.05)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(12.19±0.27vs.2.3

15、3±0.11,P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 9 Western blot實(shí)驗(yàn)?zāi)I組織ALR蛋白表達(dá)情況:與假手術(shù)組相比,對(duì)照組ALR蛋白表達(dá)增加(0.62±0.02vs.0.69±0.03,P＜0.05),而rALR組表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(0.82±0.05vs.0.69±0.03,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 10 Western blot實(shí)驗(yàn)肝組織ALR蛋白表達(dá)情況:與假手術(shù)組相比,對(duì)照組AL

16、R蛋白表達(dá)增加(0.75±0.03vs.0.80±0.05,P＜0.05),而rALR組表達(dá)較對(duì)照組明顯增加(0.89±0.02vs.0.80±0.05,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rhALR組與假手術(shù)組比較,(0.89±0.02vs.0.75±0.03,P＜0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 15/6腎切除大鼠制作慢性腎衰竭動(dòng)物模型,盡管這一方法復(fù)雜,但其機(jī)理明確,即通過(guò)減少腎組織導(dǎo)致腎功能衰竭

17、,進(jìn)一步并發(fā)貧血,模型成功率高。從生化、病理和代謝等方面接近人類(lèi)慢性腎衰竭,從而有助于探討慢性腎性貧血的發(fā)病機(jī)制。
　　 25/6腎切除大鼠慢性腎衰竭動(dòng)物模型中,肝腎組織ALR表達(dá)增加,可能為表明腎功能損害,造成貧血,肝臟腎臟ALR反應(yīng)性增加,為機(jī)體代償機(jī)制。
　　 3外源性給予rhALR后,5/6腎切除慢性腎衰竭大鼠血EPO水平升高,貧血改善。腎臟病理間質(zhì)纖維化改變減輕,肝腎組織ALR、PCNA表達(dá)明顯上調(diào),與EPO升