調(diào)控子Fur直接調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌鐵代謝功能的研究.pdf

1、鼠疫是一種古老的自然疫源性疾病,是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)引起的。而鐵的攝取與利用在細(xì)菌生長(zhǎng)和毒性中起重要作用。鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白(Fur)是革蘭氏陰性菌重要的調(diào)節(jié)子,它調(diào)控細(xì)菌對(duì)鐵的攝取和利用。雖然研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)鐵攝取系統(tǒng)受Fur調(diào)節(jié),但是至今還沒(méi)有從整體上闡明Fur如何調(diào)節(jié)鼠疫菌鐵代謝。 本研究首先基于Red系統(tǒng)一步法缺失替換鼠疫菌的fur基因,利用鼠疫全基因組DNA芯片進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究。為了鑒定鐵-Fur調(diào)控元,

2、我們比較了野生株在鐵缺乏與鐵富余條件下、以及鐵富余條件下野生株與fur突變株的全局表達(dá)譜的變化。這一分析可以從全基因組水平上篩選出所有受鐵-Fur直接或間接調(diào)控的靶基因。然后,在表達(dá)譜分析基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)、足跡實(shí)驗(yàn)、RT-PCR和引物延伸實(shí)驗(yàn)等這些經(jīng)典分子生化實(shí)驗(yàn)和生物信息學(xué)分析,鑒定出受鐵-Fur直接調(diào)控的操縱子,從而深入探究Fur對(duì)鼠疫菌鐵代謝轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。 研究表明有32個(gè)操縱子/基因受鐵-Fur直接調(diào)控

3、,其中有29個(gè)轉(zhuǎn)錄下調(diào),3個(gè)上調(diào)。根據(jù)功能可將這些操縱子/基因分為五類：鐵的攝取；運(yùn)輸；貯存；少數(shù)與鼠疫菌鐵攝取無(wú)關(guān)但與侵襲相關(guān)；還有少數(shù)基因功能未知。 為了明確Fur的精細(xì)調(diào)控機(jī)制,本研究對(duì)這些操縱子/基因進(jìn)行生物信息學(xué)計(jì)算分析,預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)與Fur的結(jié)合基序,并用DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。信息學(xué)預(yù)測(cè)與生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)合得出鼠疫菌Fur box并與大腸桿菌的Fur box進(jìn)行了比較。 鼠疫耶爾森氏菌染色體上有一段1

4、02Kb的DNA區(qū)域,為pgm位點(diǎn),它分成兩個(gè)相鄰部分：一個(gè)是hms位點(diǎn),決定血紅素儲(chǔ)存功能；另一區(qū)域包含4個(gè)操縱子(fyuA,irp2-irpl-ybtUTE, ybtA, 和ybtPQXS),與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌強(qiáng)毒力島(highpathogenicity island,HPI)中相應(yīng)基因同源,稱作耶氏桿菌素(Ybt)系統(tǒng),屬于鐵載體依賴性離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),與鼠疫菌毒力相關(guān)。在已有文獻(xiàn)以及實(shí)驗(yàn)分析基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了鼠疫菌Fur和Ybt

5、A對(duì)HPI轉(zhuǎn)錄調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)。HPI在耶爾森氏菌屬中是高度保守的,因而所研究的鼠疫菌Fur和YbtA對(duì)HPI轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制在耶爾森氏菌屬中應(yīng)該是普遍適用的。 本研究首次從整體上鑒定了鼠疫菌受鐵-Fur直接調(diào)控的調(diào)控元,同時(shí)從分子水平上明確了鼠疫菌Fur box的特性。本研究界定Fur調(diào)控元,探究了Fur轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,著重構(gòu)建了鼠疫菌Fur和YbtA對(duì)HPI轉(zhuǎn)錄調(diào)控的網(wǎng)絡(luò),為進(jìn)一步明確這些調(diào)控元的功能以及它們?cè)谑笠呔F代謝中協(xié)同作用的機(jī)